АППАРАТ ОПТИЧЕСКОГО МИКРОСКОПА

Простейшим прибором для визуальных наблюдений является лупа. Лупой называют собирающую линзу с малым фокусным расстоянием (F < 10 см). Лупу располагают близко к глазу, а рассматриваемый предмет – в ее фокальной плоскости. Предмет виден через лупу под углом

где h – размер предмета. При рассматривании этого же предмета невооруженным глазом его следует расположить на расстоянии d0 = 25 см наилучшего зрения нормального глаза. Предмет будет виден под углом

Отсюда следует, что угловое увеличение лупы равно

Линза с фокусным расстоянием 10 см дает увеличение в 2,5 раза. Работу лупы иллюстрирует рис. 6.1.1.

Для невооруженного глаза наименьший угол зрения приблизительно равен 1′. Этот угол определяется мозаичным строением сетчатки, а также волновыми свойствами света. Существует ряд приборов, предназначенных для увеличения угла зрения – лупа, микроскоп, зрительная труба. При визуальных наблюдениях глаз является неотъемлемой частью оптической системы, поэтому ход лучей в приборах, вооружающих глаз, зависит от аккомодации глаза. При анализе работы оптических приборов для визуальных наблюдений удобнее всего полагать, что глаз наблюдателя аккомодирован на бесконечность. Это означает, что лучи от каждой точки предмета, пройдя через прибор, попадают в глаз в виде параллельного пучка. В этих условиях понятие линейного увеличения теряет смысл. Отношение угла зрения ? при наблюдении предмета через оптический прибор к углу зрения ? при наблюдении невооруженным глазом называется

Угловое увеличение является важной характеристикой оптических приборов для визуальных наблюдений.

Следует отметить, что в некоторых учебниках полагается, что глаз наблюдателя аккомодирован на расстояние наилучшего зрения нормального глаза d0. В этом случае ход лучей в приборах несколько усложняется, но угловое увеличение прибора приближенно остается таким же, как и при аккомодации на бесконечность.

Микроскоп применяют для получения больших увеличений при наблюдении мелких предметов. Увеличенное изображение предмета в микроскопе получается с помощью оптической системы, состоящей из двух короткофокусных линз – объектива O1 и окуляра O2 (рис. 6.1.2).

Объектив даст действительное перевернутое увеличенное изображение предмета. Это промежуточное изображение рассматривается глазом через окуляр, действие которого аналогично действию лупы.

Окуляр располагают так, чтобы промежуточное изображение находилось в его фокальной плоскости; в этом случае лучи от каждой точки предмета распространяются после окуляра параллельным пучком.

Мнимое изображение предмета, рассматриваемое через окуляр, всегда перевернуто. Если же это оказывается неудобным (например, при прочтении мелкого шрифта), можно перевернуть сам предмет перед объективом. Поэтому угловое увеличение микроскопа принято считать положительной величиной.

Как следует из рис. 6.1.2, угол зрения предмета, рассматриваемого через окуляр в приближении малых углов,

Приближенно можно положить d = F1 и f = l, где l – расстояние между объективом и окуляром микроскопа («длина тубуса»). При рассматривании того же предмета невооруженным глазом

В результате формула для углового увеличения микроскопа приобретает вид

Хороший микроскоп может давать увеличение в несколько сотен раз. При больших увеличениях начинают проявляться дифракционные явления.

У реальных микроскопов объектив и окуляр представляют собой сложные оптические системы, в которых устранены различные аберрации.

На рис. 6.1.3 изображен ход лучей в астрономическом телескопе. Предполагается, что глаз наблюдателя аккомодирован на бесконечность, поэтому лучи от каждой точки удаленного предмета выходят из окуляра параллельным пучком. Такой ход лучей называется . В астрономической трубе телескопический ход лучей достигается при условии, что расстояние между объективом и окуляром равно сумме их фокусных расстояний F= F1 + F2.

Зрительная труба (телескоп) принято характеризовать . В отличие от микроскопа, предметы, наблюдаемые в телескоп, всегда удалены от наблюдателя. Если удаленный предмет виден невооруженным глазом под углом , а при наблюдении через телескоп под углом , то угловым увеличением называют отношение

Угловому увеличению , как и линейному увеличению, можно приписать знаки плюс или минус в зависимости от того, является изображение прямым или перевернутым. Угловое увеличение астрономической трубы Кеплера отрицательно, а земной трубы Галилея положительно.

Угловое увеличение зрительных труб выражается через фокусные расстояния:

В качестве объектива в больших астрономических телескопах применяются не линзы, а сферические зеркала. Такие телескопы называются . Хорошее зеркало проще изготовить, кроме того, зеркала в отличие от линз не обладают хроматической аберрацией.

У нас в стране построен самый большой в мире телескоп с диаметром зеркала 6 м. Следует иметь в виду, что большие астрономические телескопы предназначены не только для того, чтобы увеличивать угловые расстояния между наблюдаемыми космическими объектами, но и для увеличения потока световой энергии от слабосветящихся объектов.

I. Микроскоп как оптическая система.

Ход лучей в микроскопе.

Микроскоп — сложная оптическая система с двумя ступенями увеличения и предназначенная для наблюдения в увеличенном виде близко расположенных предметов.

I ступень – объектив- центрическая система из 4-10 линз для непосредственного рассмотрения объекта и формирования промежуточного изображения, расположенного перед окуляром.

II ступень — окуляр — система из 2-5 линз, предназначенная для рассматривания промежуточного изображения.

Для построения изображения в микроскопе нужно:

— объектив и окуляр изобразить в виде тонких собирающих линз

— выбрать 2 луча: один через оптический центр, другой — параллельно главной оптической оси

— расположить предмет перед передним главным фокусом объектива

— построить промежуточное изображение (оно получится за двойным фокусным расстоянием объектива, увеличенное, действительное, обратное). Оно будет располагаться ближе главного фокуса окуляра.

— построить окончательное изображение, которое формирует окуляр. Оно увеличенное, мнимое, прямое и будет находиться на расстоянии L=25см наилучшего

l — высота предмета

l1 –высота промежуточного изображения

l2 –высота конечного изображения

L — условное расстояние (расстояние наилучшего видения), на котором глаз под достаточно большим углом зрения может длительно осуществлять зрительную работу(L ≈ 25 см).

Δ – оптическая длина тубуса ≈ 10-15 см.

II. Основные характеристики микроскопа.

1. Увеличение – это безразмерная величина, равная отношению линейного или углового размера изображения к линейному или угловому размеру объекта. На практике чаще используется линейное изображение. Т. к. микроскоп — это двухступенчатая система, то его общее увеличение состоит из увеличения объектива Гоб и увеличения окуляра Гок.

Гоб=l1/l; Гок=l2/l1 ;

Гобщ=Гоб*Гок = l1/l * l2/l1 = l2/l

l2 — размер окончательного изображения

l1 – размер промежуточного изображения

l — размер объекта

На практике используется вторая формула увеличения микроскопа, представленная через фокусные расстояния объектива«fоб»и окуляра «fок», через оптическую длину тубуса «Δ»и расстояние наилучшего видения «L».

Вывод: увеличения объектива и окуляра гравируется на их оправах и у обычных биологических микроскопов объективы имеют увеличение 8, 10, 20, 40, 90 раз. У исследовательских — 100 раз. Окуляры имеют увеличения 5, 7, 10, 20 раз. У самого лучшего современного микроскопа увеличение составит 100* 20 = 2000 раз, у обычного 90 * 15 = 1350 раз.

2. Числовая апертура — безразмерная величина, характеризующая светособирающую и разрешающую способности микроскопа.

«А» (апертура) — численно равна произведению показателя преломляющей среды между объектом и объективом на «sin» апертурного угла

А = n · sinφ

φ — апертурный угол, под которым из точки, находящейся в главном фокусе объектива виден радиус «r» передней линзы объектива.

Микроскоп (от греч. mikros — малый и skopeo — смотрю) — оптический прибор для получения увеличенного изображения мелких объектов и их деталей, невидимых невооруженным глазом.

Первый из известных микроскопов был создан в 1590 году в Нидерландах потомственными оптиками Захарием и Хансом Янсенами, смонтировавшими две выпуклые линзы внутри одной трубки. Позднее Декарт в своей книге «Диоптрика» (1637) описал более сложный микроскоп, составленный из двух линз — плоско-вогнутой (окуляр) и двояковыпуклой (объектив). Дальнейшее же совершенствование оптики позволило Антони ван Левенгуку в 1674 г. изготовить линзы с увеличением, достаточным для проведения простых научных наблюдений и впервые в 1683 году описать микроорганизмы.

Современный микроскоп (рисунок 1) состоит из трех основных частей: оптической, осветительной и механической.

1 — основание микроскопа; 2 — коробка с механизмом микрометрического фокусирования; 3 — микрометрический винт; 4 — макрометрический винт; 5 и 6 — винты для перемещения столика; 7 — тубусодержатель; 8 — головка микроскопа; 9 — насадка монокулярная (тубус с окуляром); 10 — винт для крепления насадки; 11 — винт, фиксирующий револьвер относительно тубуса; 12 — револьвер с объективами; 13 — предметный столик; 14 — винт для крепления конденсора; 15 — конденсор; 16 — дополнительная линза; 17 — рукоятка кронштейна; 18 — зеркало; 19 — кронштейн. Рисунок 1 — Схема микроскопа «Биолам»

Основными деталями оптической части микроскопа являются две системы увеличительных линз: обращенный к глазу исследователя окуляр и обращенный к препарату объектив. Окуляры имеют две линзы, верхняя из которых называется главной, а нижняя собирательной. На оправе окуляров обозначают производимое ими увеличение (×5, ×7, ×10, ×15). Количество окуляров у микроскопа может быть различным, в связи с чем различат монокулярные и бинокулярные микроскопы (предназначены для наблюдения за объектом одним или двумя глазами), а также тринокуляры, позволяющие подключать к микроскопу системы документирования (фото- и видеокамеры).

Объективы представляют собой систему линз, заключенных в металлическую оправу, из которых передняя (фронтальная) линза производит увеличение, а лежащие за ней коррекционные линзы устраняют недостатки оптического изображения. На оправе объективов цифрами также указано производимое ими увеличение (×8, ×10, ×40, ×100). Большинство моделей, предназначенных для микробиологических исследований, имеют в комплекте несколько объективов с разными степенями увеличения и поворотный механизм, предназначенный для их быстрой смены – турель, часто называемый «револьверной головкой».

Осветительная часть предназначена для создания светового потока, который позволяет осветить объект таким образом, чтобы оптическая часть микроскопа предельно точно выполняла свои функции. Осветительная часть в прямых микроскопа проходящего света расположена за объектом под объективом и включает в себя источник света (лампу и электрический блок питания) и оптико-механическую систему (конденсор, полевую и апертурную регулируемую диафрагмы). Конденсор состоит из системы линз, которые предназначены для собирания идущих от источника света лучей в одной точке – фокусе, которая должна находиться в плоскости рассматриваемого объекта. В свою очередь д иафрагма расположена под конденсором и предназначена для регулирования (увеличения или уменьшения) потока лучей, проходящих от источника света.

Механическая часть микроскопа содержит детали, объединяющие описанные выше оптическую и осветительную части, а также позволяющие размещать и перемещать исследуемый препарат. Соответственно, механическая часть состоит из основания микроскопа и держателя, к верхней части которого прикрепляются тубус – полая трубка, предназначенная для размещения объектива, а также упомянутая выше револьверная головка. Ниже находится предметный столик, на который устанавливаются предметные стекла с исследуемыми образцами. Предметный столик может перемещаться в горизонтальной плоскости с использованием соответствующего устройства, а также вверх и вниз, что обеспечивает настройку резкости изображения с помощью грубого (макрометрического) и точного (микрометрического) винтов.

Увеличение, которое дает микроскоп, определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. Кроме светопольной микроскопии широкое применение в специальных методах исследования плучили: темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная (флюоресцентная) и электронная микроскопия.

М етод светлого поля в проходящем свете применяется для изучения прозрачных объектов с неоднородными включениями (простейшие и бактерии в жидкостях, тонкие срезы растительных и животных тканей, тонкие полированные пластинки некоторых минералов). При выполнении данного вида микроскопии пучок лучей из осветительной системы проходит сквозь препарат и дает равномерно освещенное поле в плоскости изображения. В свою очередь элементы структуры препарата частично поглощают и отклоняют падающий на них свет, что и обусловливает появление изображения.

Микроскоп — сложная  оптическая  система  с  двумя   ступенями  увеличения. Предназначен  для  наблюдения  в  увеличенном  виде  близкорасположенных  предметов.

Центрическая  система — система  линз, оптические  центры  которых  находятся  в  одной  плоскости.

Для  построения  изображения  в  микроскопе  необходимо:

L — расстояние  наилучшего  зрения (25-30 см) — расстояние, на  котором  глаз  под  большим  углом  зрения  может  длительно  осуществлять  зрительную  работу.

F1 и F2 — фокусные  расстояния  линз  1 и  2 соответственно.

2. Основные  характеристики  микроскопа:

1) Увеличение  микроскопа (ГМ) — безразмерная  величина,  равная  отношению  размера  окончательного  изображения  к  размеру  предмета.

I. Г М  = Гобъектива * Гокуляра

Гобъектива =  l1/l2;    Гокуляра = l2/l1;

ГМ = (l1*l2)/(l*l1);

Гм  = l2/l.

II. Гм = (Δ*L)/(f1*f2).

Δ- длина  тубуса,

L — расстояние  наилучшего  зрения,

f1 и f2 — фокусы  объектива  и  окуляра.

Увеличения  окуляра  и  объектива  гравируются  на   их  оправах.  У  обычных  биологических  микроскопов  объективы  дают  увеличение  8, 10, 20, 40  и  90;  окуляры  имеют  увеличение   5, 7, 10  и  20.  У  исследовательских  микроскопов  увеличение  окуляра  20,  объектива  — 100.

2)  Числовая  апертура (A) — она  характеризует  светособирающую  и  разрешающую  способность микроскопа.  Апертура  равна  произведению  показателя  преломления  среды,  находящейся  между  предметом  и  объективом,  на  синус  апертурного  угла.

Апертурный  угол (u)- это  тот  угол, под  которым  из  точки, находящейся   в главном  корпусе  объектива,  виден  радиус  передней  линзы  объектива.

A = n* sin u.

n — коэффициент  преломления,

A — числовая  апертура,

u — апертурный  угол.

Средой  между  предметом  и  объективом  могут  быть:

Каждый  объектив  предназначен  для  конкретной  среды.  Апертурный  угол  для  воздушной  среды  составляет  0º- 40º,  для  иммерсионной — 1º-30º.  Апертура  объектива  гравируется  его  на  оправе  вместе  с  увеличением. Наименьшая  апертура — 0,2.  Наибольшая  1,3  у  иммерсионных  объективов  с  увеличением  100.

3) Разрешающая  способность( R ) — способность  оптической  системы  давать  раздельные  изображения  двух  предельно  близко  расположенных  точек  объекта  или  его  структур.  Разрешающая  способность  обратнопропорциональна  пределу  разрешения.

Предел  разрешения (d) — минимальное  расстояние,  на  которое  две  структуры  видны  раздельно.

R = 1/d.

Экспериментально  установлено, что  предел  разрешения  зависит  от  длины  волны  света (Λ — «лямбда»)  и  от  числовой  апертуры (А)  микроскопа:

Следовательно, для  повышения  разрешающей  способности  микроскопа  надо  использовать  коротковолновые  излучения  и  объектив  с  большой  числовой  апертурой (иммерсионные  среды).

3. Оптическая  система  глаза. Светопроводящая  и  световоспринимающая  части  глаза.

1)склеры — внешней  белковой  оболочки,

2)роговицы — n = 1,15; толщина ≈ 1 мм,

3)сосудистой  оболочки — препятствующей  рассеянию  света  в  глазу  и  служит  для  защиты  светочувствительных  элементов,

5)зрачка — круглого  отверстия  в  радужной  оболочке,  с  изменением  которого  изменяется  поток  проходящего  света;

6)хрусталика — природной  двояковыпуклой   линзы  с  коэффициентом  преломления  1,4. Кольцевая   мышца  охватывает  хрусталик  и  изменяет  кривизну  его  поверхности;

7)передней  камеры — камеры  со  студенистой  массой(n ≈ n ВОДЫ = 1,33);

9)сетчатки — состоит  из  нескольких  слоев  рецепторных  клеток;

10)стекловидного  тела — прозрачной  студенистой  массы, которая  занимает  объем  глаза  между  хрусталиком  и  сетчаткой;

11)желтого  пятна (место  выхода  зрительного  нерва  из  глаза).

2. светопреломляющая  и  светопередающая;

3. светорегулирующая  и

Светопроводящая  часть  глаза  образуется  роговицей, хрусталиком,  жидкостью  передней  камеры  и  стекловидным  телом.  Главная  оптическая  ось  проходит  через  центры  роговицы, зрачка, хрусталика.  Глаз — центрированная  оптическая  система.

Световоспринимающая  часть (или  рецепторный  аппарат) — это  сетчатка, в  которой  находятся  светочувствительные  зрительные  клетки. Направление  наибольшей  чувствительности  определяет  зрительная  ось. Она  проходит  через  центры  роговицы  и  желтого  пятна. В  направлении  этой  оси  глаз  имеет  наилучшую  разрешающую  способность.  Угол  между  оптической  и  зрительной  осями  составляет  5º.

Оптическая  сила  глаза (D)- это  алгебраическая  сумма  сил  всех  основных  преломляющих  сред.

D = 1/F;

В  глазу    D РОГОВИЦЫ  равен  42-43 дптр;  D ХРУСТАЛИКА — до  33 дптр;     DСТЕКЛОВИДНОГО ТЕЛА — 5 — 6 дптр. Первые  две  среды  подобны  собирающим  линзам, последняя — рассеивающей.

Для  построения  изображения  на  сетчатке  и  анализа  связанных  с  этим  явлений  пользуются  приведенным (редуцированным)  глазом. Здесь  рассматривается  однородная  сферическая  линза  с  коэффициентом   преломления (n)  равным  1,4  и  D В ПОКОЕ = 63  дптр, D ПРИ НАПРЯЖЕНИИ = 70 дптр.  Построение  изображения  делается  по  обычным  правилам.  Если  предмет  расположен  на  расстоянии  большем, чем  двойное  фокусное, то  оно  получается  действительным,  уменьшенным  и  обратным.

Микроскоп

Микроскоп предназначен для наблюдения мелких объектов с большим увеличением и с большей разрешающей способностью, чем дает лупа. Оптическая система микроскопа состоит из двух частей:
объектива и окуляра. Объектив микроскопа образует действительное увеличенное обратное изображение предмета в передней фокальной плоскости окуляра. Окуляр действует как лупа и образует мнимое изображение
на расстоянии наилучшего видения (рис. 6.4). По отношению ко всему микроскопу рассматриваемый предмет располагается в передней фокальной плоскости.

Рис. 6.4. Оптическая схема микроскопа.

Увеличение микроскопа

Действие микрообъектива характеризуют его линейным увеличением:

– фокусное расстояние микрообъектива,

– расстояние между задним фокусом объектива и передним фокусом окуляра, называемое оптическим интервалом или оптической длиной тубуса.

Изображение, создаваемое объективом микроскопа в передней фокальной плоскости окуляра рассматривается через окуляр, который действует как лупа с видимым увеличением:

Общее увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра:

Если известно фокусное расстояние всего микроскопа, то его видимое увеличение можно определить так же, как и у лупы:

Как правило, увеличение современных объективов микроскопов стандартизованное и составляет ряд чисел: 10, 20, 40, 60, 90, 100 крат. Увеличения окуляров тоже имеют вполне определенные
значения, например 10, 20, 30 крат. Во всех современных микроскопах имеется комплект объективов и окуляров, которые специально рассчитываются и изготавливаются так, что подходят друг к другу, поэтому
их можно комбинировать для получения разных увеличений.

Поле зрения микроскопа

Поле зрения микроскопа зависит от углового поля окуляра

, в пределах которого получается изображение достаточно хорошего качества:

При данном угловом поле окуляра линейное поле микроскопа в пространстве предметов тем меньше, чем больше его видимое увеличение.

Диаметр выходного зрачка
микроскопа

Диаметр выходного зрачка микроскопа вычисляется следующим образом:

– передняя апертура микроскопа.

Диаметр выходного зрачка микроскопа обычно немного меньше диаметра зрачка глаза (0.5 – 1 мм).

При наблюдении в микроскоп зрачок глаза нужно совмещать с выходным зрачком микроскопа.

Разрешающая способность
микроскопа

Одной из важнейших характеристик микроскопа является его разрешающая способность. Согласно дифракционной теории Аббе, линейный предел разрешения микроскопа, то есть минимальное
расстояние между точками предмета, которые изображаются как раздельные, зависит от длины волны и числовой апертуры микроскопа:

Предельно достижимую разрешающую способность оптического микроскопа можно сосчитать, исходя из выражения для апертуры микроскопа (

). Если учесть, что максимально возможное значение синуса угла – единичное (

), то для средней длины волны

можно вычислить разрешающую способность микроскопа:

Из выражения (6.11) следует, что повысить разрешающую способность микроскопа можно двумя способами: либо увеличивая апертуру объектива, либо уменьшая длину волны света, освещающего
препарат.

Иммерсия

Для того чтобы увеличить апертуру объектива, пространство между рассматриваемым предметом и объективом заполняется так называемой иммерсионной жидкостью – прозрачным веществом
с показателем преломления больше единицы. В качестве такой жидкости используют воду (

), кедровое масло (

), раствор глицерина и другие вещества. Апертуры иммерсионных объективов большого увеличения достигают величины

, тогда предельно достижимая разрешающая способность иммерсионного оптического микроскопа составит

Применение ультрафиолетовых лучей

Для увеличения разрешающей способности микроскопа вторым способом применяются ультрафиолетовые лучи, длина волны которых меньше, чем у видимых лучей. При этом должна быть
использована специальная оптика, прозрачная для ультрафиолетового света. Поскольку человеческий глаз не воспринимает ультрафиолетовое излучение, необходимо либо прибегнуть к средствам, преобразующим
невидимое ультрафиолетовое изображение в видимое, либо фотографировать изображение в ультрафиолетовых лучах. При длине волны

разрешающая способность микроскопа составит

Кроме повышения разрешающей способности, у метода наблюдения в ультрафиолетовом свете есть и другие преимущества. Обычно живые объекты прозрачны в видимой области спектра, и поэтому перед
наблюдением их предварительно окрашивают. Но некоторые объекты (нуклеиновые кислоты, белки) имеют избирательное поглощение в ультрафиолетовой области спектра, благодаря чему они могут быть «видимы»
в ультрафиолетовом свете без окрашивания.

Полезное увеличение микроскопа

Глаз наблюдателя сможет воспринимать две точки как раздельные, если угловое расстояние между ними будет не меньше углового предела разрешения глаза. Для того чтобы глаз наблюдателя
мог полностью использовать разрешающую способность микроскопа, необходимо иметь соответствующее видимое увеличение.

– это видимое увеличение, при котором глаз наблюдателя будет полностью использовать разрешающую способность
микроскопа, то есть разрешающая способность микроскопа будет такая же, как и разрешающая способность глаза.

Если две точки в передней фокальной плоскости микроскопа расположены друг от друга на расстоянии

, то угловое расстояние между изображениями этих точек

. Из выражений (6.11) и (6.8) можно вывести видимое увеличение микроскопа:

Поскольку обычно диаметр выходного зрачка микроскопа около 0.5 – 1 мм, угловой предел разрешения глаза 2´ – 4´. Если взять среднюю длину волны в видимой области спектра
(0.5 мкм), то для полезного увеличения микроскопа можно вывести зависимость:

Микроскоп с видимым увеличением меньше 500А не позволяет различать глазом все тонкости структуры предмета, которые изображаются как раздельные данным объективом (

). Использование видимого увеличения больше 1000А нецелесообразно, так как разрешающая способность объектива не позволяет полностью использовать
разрешающую способность глаза (

Темнопольная и фазово-контрастная микроскопия

Возможность наблюдения микроорганизмов в живом (неокрашенном) состоянии обеспечивается использованием темнопольной и фазово-контрастной микроскопии, требующих использования специальных конденсоров и позволяющих получать черно-белые изображения исследуемых микроорганизмов с возможностями изучения их формы, подвижности, деления и т.д.

Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля, известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. Данный вид микроскопии впервые был предложен австрийскими учеными Р. Зигмонди и Р. Зидентопфом в 1903 г. При его выполнеии объект освещают не снизу, а сбоку, в результате чего прямые лучи от осветителя в объектив микроскопа не попадают и поле зрения остается темным. Подобный тип освещения достигается использованием специального темнопольного конденсора (параболоида или кардиоида) с затемненной центральной частью.

Кроме того, чтобы в объектив не попадали прямые лучи от осветителя, апертура объектива должна быть меньше, чем апертура конденсора (для уменьшения апертуры в обычный объектив помещают диафрагму или пользуются специальными объективами, снабженными ирисовой диафрагмой). В свою очередь объект освещается косыми боковыми лучами и в объектив микроскопа попадают только лучи, рассеянные частицами, находящимися в препарате. Сказанное объясняет, почему при темнопольной микроскопии микроорганизмы выглядят ярко светящимися на черном фоне (рисунок 3). Ограничениями же темнопольной микроскопии является то, что она позволяет увидеть только контуры объекта, но не дает возможности изучать его внутреннюю структуру.

В основе метода фазово-контрастной микроскопии, также предназначенного для наблюдения микроорганизмов в живом (неокрашенном) состоянии лежит иной физический принцип, впервые предложенный Ф. Цернике в1935 году (Нобелевская премия по физике, 1953 г.). Суть его заключается в том, что в обычных условиях при прохождении пучка света через неокрашенный объект, отличающихся от окружающей среды только по показателю преломления, изменяется лишь фаза колебания световой волны, не воспринимаемая человеческим глазом.

Чтобы изображение стало контрастным необходимо превратить фазовые изменения световой волны в видимые амплитудные, что достигается с помощью специального фазово-контрастного устройства. Основными деталями подобного устройства, которое может быть установлено на любом световом микроскопе, являются фазовоконтрастный конденсор и фазовый объектив. Фазовоконтрастный конденсор представляет собой револьверную конструкцию, в которой установлены кольцевые диафрагмы, обеспечивающие освещение препарата полным конусом света и соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов.

В свою очередь фазовый объектив отличаются от обычных тем, что в их главном фокусе расположена фазовая пластинка, имеющая форму кольца и получаемая нанесением солей редкоземельных элементов на объектив. При этом установку освещения проводят так, чтобы весь свет, прошедший через кольцевидную диафрагму конденсора, в дальнейшем прошел через расположенное в объективе фазовое кольцо.

При изучении препарата весь свет, прошедший через его участки, в которых нет каких-либо объектов, без изменений пройдет и через фазовое кольцо, обусловив светлое изображение фона. В свою очередь свет, прошедший через имеющиеся в препарате частицы, например, бактериальные клетки, получит некоторое изменение фазы и, кроме того, разделится на два луча — недифрагированный и дифрагированный.

Недифрагированные лучи, пройдя в дальнейшем через кольцевидную фазовую пластинку в объективе, получат дополнительный сдвиг фазы. Дифрагированные лучи пройдут мимо фазовой пластинки, и их фаза не изменится. В плоскости же полевой диафрагмы окуляра произойдет интерференция (наложение) дифрагированного и недифрагированного лучей, а так как они идут в разных фазах, произойдет их взаимное частичное гашение с уменьшением амплитуды. Благодаря применению этого метода микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов относительно фона резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст).

Фaзoвoму кoнтpacту пpиcущ эффeкт Гaлo — появление светящегося ореола по контуру изображения объекта, что затрудняет изучение cвoйcтв кpaeвыx cтpуктуp наблюдаемых объектов, нaпpимep, не позволяет тoчнo зaмepять углы или расстояния. Для устранения данного недостатка используется вариант фазово-контрастной микроскопии – так называемый «хоффмановский контраст». Другой разновидностью данного метода является аноптральная микроскопия, преимуществами которой являются большая разрешающая способность с выявлением минимальных разностей плотности в неокрашенных препаратах.

Электронная микроскопия

Теоретические основы использования электронов для наблюдения микроскопических объектов были заложены У. Гамильтоном, установившим аналогию между прохождением световых лучей в оптически неоднородных средах и траекториями частиц в силовых полях, а также де Бройлем, выдвинувшим гипотезу о существовании у электрона одновременно корпускулярных и волновых свойств.

При этом, благодаря чрезвычайно малой длине волны электронов, которая уменьшается в прямой зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, теоретически рассчитанный предел разрешения, характеризующий способность прибора отобразить раздельно мелкие, максимально близко расположенные детали объекта, у электронного микроскопа составляет 2-3 Å (Ангстрем, где 1Å=10-10м), что в несколько тысяч раз выше, чем у оптического микроскопа. Первое изображение объекта, сформированное пучками электронов, было получено в 1931г. немецкими учеными М. Кноллем и Э. Руска.

В конструкциях современных электронных микроскопов источником электронов служит металл (обычно вольфрам), из которого после его нагревания до 2500 ºС в результате термоэлектронной эмиссии испускаются электроны. С помощью электрических и магнитных полей формирующийся поток электронов можно ускорять и замедлять, а также отклонять в любых направлениях и фокусировать. Таким образом, роль линз в электронном микроскопе играет совокупность соответствующим образом рассчитанных магнитных, электростатических и комбинированных устройств, называемых «электронными линзами».

Необходимым условием перемещения электронов в виде пучка на большое расстояние является также создание на их пути вакуума, поскольку в этом случае средняя длина свободного пробега электронов между столкновениями с газовыми молекулами будет значительно превышать расстояние, на которое они должны перемещаться. Для этих целей достаточно поддерживать в рабочей камере отрицательное давление приблизительно 10-4 Па.

По характеру исследования объектов электронные микроскопы разделяют на просвечивающие, отражательные, эмиссионные, растровые, теневые и зеркальные, среди которых первые два являются наиболее часто используемыми.

Оптическая схема просвечивающего (трансмиссионного) электронного микроскопа полностью эквивалентна соответствующей схеме оптического микроскопа, в котором световой луч заменяется электронным лучом, а системы стеклянных линз заменяются системами электронных линз. Соответственно, просвечивающий электронный микроскоп состоит из следующих основных узлов: осветительной системы, камеры объекта, фокусирующей системы и блока регистрации конечного изображения, состоящего из фотокамеры и флуоресцирующего экрана.

Все эти узлы соединены друг с другом, образуя так называемую «колонну микроскопа», внутри которой поддерживается вакуум. Другим важным требованием, предъявляемым к исследуемому объекту, является его толщина менее чем 0,1 мкм. Окончательное же изображение объекта формируется после соответствующей фокусировки прошедшего сквозь него пучка электронов на фотопленке или флюоресцирующем экране, покрытом специальным веществом – люминофором (аналогичен экрану в кинескопах телевизоров) и превращающем электронное изображение в видимое.

При этом образование изображения в просвечивающем электронном микроскопе связано главным образом с различной степенью рассеяния электронов различными участками исследуемого образца и в меньшей мере с различием в поглощении электронов этими участками. Контраст усиливают также, применяя «электронные красители» (четырёхокись осмия, уранил и др.), избирательно связывающиеся с некоторыми участками объекта. Устроенные подобным образом современные просвечивающие электронные микроскопы обеспечивают максимальное полезное увеличение до 400000 раз, что соответствует разрешающей способности в 5,0 Å. Выявляемое с использованием просвечивающей электронной микроскопии тонкое строение бактериальных клеток называют ультраструктурой.

В отражательном (сканирующем) электронном микроскопе изображение создается с помощью электронов, отраженных (рассеянных) поверхностным слоем объекта при его облучении под малым углом (приблизительно несколько градусов) к поверхности. Соответственно, образование изображения обусловлено различием рассеяния электронов в разных точках объекта в зависимости от его поверхностного микрорельефа, а сам результат подобной микроскопии предстает в виде структуры поверхности наблюдаемого объекта. Контрастность может быть усилена напылением на поверхность объекта частиц металла. Достигнутая разрешающая способность микроскопов такого типа составляет порядка 100 Å.

Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия

Основы люминесцентной микроскопии были заложены А. Келером, обосновавшим принципиальную возможность подобного метода исследования. Первое устройство для его осуществления впервые было создано в 1911 г., однако широкое распространение получило двумя десятилетиями позже, когда для окрашивания препаратов были предложены специальные вещества – флюорохромы, избирательно связывающиеся с определенными структурами клеток (М. Хайтингер, 1933-1935). Чуть позже было предложено коньюгировать флюорохромы с антителами, что положило начало метода иммунофлюоресценции (А. Н. Кунс, 1942). В бывшем СССР наибольший вклад в развитие метода люминесцентной микроскопии и создание отечественной промышленностью люминесцентных микроскопов и устройств, основанных на этом принципе, внес М. Н. Мейсель (1953).

В основе люминесцентной микроскопии (от лат. lumen — свет; греч. micros — малый + skopeo — рассматривать) лежит принцип люминесценции (видимого глазом свечения) микроорганизмов, клеток, тканей или отдельных структур. При этом физические основы возникновения свечения связаны с процессом поглощения определенными молекулами падающего на них света с последующим испусканием квантов с другой (большей) длиной волны (правило Стокса).

Первичная (собственная) флюоресценция возникает без специальной обработки препаратов и присуща ряду биологически активных веществ, таких, как ароматические аминокислоты, порфирины, хлорофилл, витамины А, В2, В1, некоторые антибиотики (тетрациклин) и химиотерапевтические вещества (акрихин, риванол). Вторичная (наведенная) флюоресценция возникает в результате обработки микроскопируемых объектов флюоресцирующими красителями – флюорохромами. Некоторые из этих красителей диффузно распределяются в клетках, другие избирательно связываются с определёнными структурами клеток или даже с определёнными химическими веществами.

Для проведения данного вида микроскопии используются специальные люминесцентные (флюоресцентные) микроскопы, отличающиеся от обычного светового микроскопа наличием мощного источника освещения (ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления или галогеновая кварцевая лампа накаливания), излучающего преимущественно в длинноволновой ультрафиолетовой или коротковолновой (сине-фиолетовой) области видимого спектра.

Данный источник используется для возбуждения флюоресценции, прежде, чем испускаемый им свет проходит через специальный возбуждающий (сине-фиолетовый) светофильтр и отражается интерференционной светоделительной пластинкой, почти полностью отсекающими более длинноволновое излучение и пропускающими только ту часть спектра, которая возбуждает флюоресценцию. При этом в современных моделях люминесцентных микроскопов возбуждающее излучение попадает на препарат через объектив (!) После же возбуждения флюоресценции возникающий свет вновь попадает в объектив, после чего проходит через расположенный перед окуляром запирающий (желтый) светофильтр, отсекающий коротковолновое возбуждающее излучение и пропускающий свет люминесценции от препарата к глазу наблюдателя.

В силу использования подобной системы светофильтров интенсивность свечения наблюдаемого объекта обычно невелика, в связи с чем люминесцентную микроскопию следует проводить в специальных затемненных помещениях.

Важным требованием при выполнении данного вида микроскопии является также применение нефлюоресцирующих иммерсионных и заключающих сред. В частности, для гашения собственной флюоресценции кедрового или иного иммерсионного масла к нему добавляют небольшие количества нитробензола (от 2 до 10 капель на 1 г). В свою очередь в качестве заключающих сред для препаратов могут быть использованы буферный раствор глицерина, а также нефлюоресцирующие полимеры (полистирол, поливиниловый спирт). В остальном при проведении люминесцентной микроскопии применяют обычные предметные и покровные стёкла, пропускающие излучение в используемой части спектра и не обладающие собственной люминесценцией.

Соответственно, важными преимуществами люминесцентной микроскопии являются:

1) цветное изображение;

2) высокая степень контрастности самосветящихся объектов на черном фоне;

3) возможность исследования клеточных структур, избирательно поглощающих различные флуорохромы, являющиеся при этом специфическими цитохимическими индикаторами;

4) возможность определения функционально-морфологических изменений клеток в динамике их развития;

5) возможность специфического окрашивания микроорганизмов (с использованием иммунофлюоресценции).