ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО ИНТЕРФЕРИЧЕСКИЙ КОНТРАСТ

Исследования структуры металлов и сплавов в металлографии проводятся преимущественно по методу «светлого поля», в основе которого лежит принцип отражения пучка световых лучей от поверхности полированного образца (шлифа). Этот метод является достаточным для решения большинства металловедческих задач. Тем не менее, при использовании светлопольного освещения не всегда возможно получить контрастное изображение. Это может быть связано как с трудностями в подборе состава травящего реактива, так и с наличием специфической морфологии поверхности образца. Задача повышения контраста изображения может быть решена, в том числе, при использовании цветового анализа структуры.

Рисунок  1. Пример выявления структуры чугуна (а) и сплава Ni-Ti (б).

Дифференциальная интерференционно-контрастная микроскопия (интерференционно-контрастная микроскопия или микроскопия ) — световая оптическая микроскопия, используемая для создания контраста в неокрашенных прозрачных образцах. Д ИК-микроскоп позволяет определить оптическую плотность исследуемого объекта, используя интерференцию света, и таким образом увидеть недоступные глазу детали. Относительно сложная оптическая система позволяет создать чёрно-белую картину образца на сером фоне. Это изображение подобно тому, которое можно получить с помощью фазово-контрастного микроскопа, но в нём отсутствует дифракционное гало.

В ДИК-микроскопе поляризованный луч из источника света разделяется на два луча, которые проходят через образец разными оптическими путями. Длина этих оптических путей (то есть произведение показателя преломления и геометрической длины пути) различна. Впоследствии эти лучи интерферируют при слиянии. Это позволяет создать объемное рельефное изображение, соответствующее изменению оптической плотности образца, акцентируя линии и границы. Эта картина не является точной топографической картиной.

Структуры металлов и сплавов в ДИК

Пример того, как может изменяться окраска образца при перемещении ДИК-призмы, показан на рис 6. Здесь представлено соединение разнородных металлов сваркой. Разные половины образца имеют разные свойства и полируются неравномерно. Поэтому материал по разные стороны от шва имеет некоторое различие в высоте, что и проявляется при использовании метода ДИК.

Рисунок 6. Варианты окрашивания структуры при различных положениях призмы Номарского; сварной шов, шлиф.

Дифференциально-интерференционный контраст Номарского (DIC, ДИК)

Дифференциально-интерференционный метод контрастирования (DIC) является, в некотором виде, комбинацией методов фазового и поляризационного контраста. В проходящем свете дифференциально-интерференционный контраст реализуется несколько сложнее из-за использования двух ДИК-призм (двулучепреломляющие призмы). Ход лучей при ДИК контрастировании схож с поляризационным методом, но дополнительно в оптический путь вводятся две ДИК-призмы — в конденсор и вблизи зрачка объектива. Призма в конденсоре осуществляет векторное разложение плоскополяризованного света по двум взаимноперпендикулярным направлениям колебаний и смещает их в боковом направлении так, что в препарате возникает боковое смещение составляющее дельта Х = к * лямбда. К — коэффициент смещения, обычно меньше единицы.

Дифференциально-интерференционный контраст (ДИК контраст) в отраженном свете.1 — осветитель, 2 — поляризатор, 3 — дихроичное зеркало, 4 — ДИК призма, 5 — объектив, 6 — образец, 7а — лямбда-пластина, 7 — анализатор

Дифференциально-интерференционный контраст (ДИК контраст) в проходящем свете.1 — поляризатор, 2 — ДИК призма, 3 — конденсор, 4 — образец, 5 — объектив, 6 — ДИК призма объектива, 7а — лямбда пластина, 7 — анализатор, 8 — тубусная линза

Далее вспомним метод фазового контраста. Если оба частичных луча пройдут через совершенно одинаковые структуры, то они не приобретут разность хода. Но если для частичных пучков имеются различные условия (разная оптическая плотность образца), то каждый из них на выходе из образца приобретает свою разность хода. Частичные пучки собираются второй ДИК призмой, анализатор выбирает из смещенных по фазе волновых комплектов только те, которые колеблются в направлении анализатора. Таким образом, после анализатора мы получаем лучи, колеблющиеся в одном направлении и разные по фазе. Накладываясь друг на друга, лучи интерферируются и, таким образом, фазовый сдвиг превращается в разность интенсивности. Посредством лямбда-пластины достигается дополнительный цветовой контраст. Метод показывает только «продольные» изменения, следствием чего является получение рельефных изображений. Д ИК в проходящем свете превосходно подходит для отображения отдельных сечений неокрашенных толстых объектов.

ДИК с компенсаторами Сенармона для инвертированных микроскопов

Инвертированные микроскопы проходящего света (для исследования тканевых культур) часто оснащаются оптическими компонентами для работы по методу дифференциально-интерференционного контраста, с целью облегчения визуализации, фотографирования и получения цифровых изображений различных прозрачных образцов, включая живые клетки, эмбрионы и срезы тканей. С инвертированными микроскопами могут использоваться как традиционная, так и сенармоновская оптическая ДИК-система. Основным различием между ДИК-конфигурациями прямого и инвертированного микроскопов является конденсорная система: для конденсора инвертированного микроскопа, в общем случае, требуются специальные оптические компоненты, обеспечивающие большое рабочее расстояние. Во многих случаях конструкция объективов инвертированных микроскопов также должна обеспечивать работу с большими или сверхбольшими рабочими расстояниями, соответствующими конусам света, выходящего из апертуры конденсора.

Рис. 7. Вольфрамово-галогенный осветитель

В наиболее популярной конструкции инвертированного микроскопа револьверный держатель объективов помещается под механическим предметным столиком, где соединяется с корпусом микроскопа при помощи промежуточного тубуса, либо подсоединяется непосредственно к главной внутренней оптической системе. В револьверные держатели некоторых моделей можно вставлять неподвижные ДИК-призмы Номарского в скользящих оправах (см. рисунок 4), идентичные призмам, использующимся в прямых микроскопах. В других моделях микроскопов применяется одна, установленная в длинную прямоугольную оправу, скользящая призма Номарского, которая используется со всеми объективами (от 10x до 100x; традиционная ДИК-система Номарского). Оправа призмы Номарского устанавливается под револьверным держателем, в промежуточном тубусе, что позволяет легко демонтировать светоделитель и убирать его из оптического пути, для получения изображений в режимах светлого поля, фазового контраста, модуляционного контраста Хоффмана и др. Фазовый сдвиг создается при помощи рукоятки, расположенной на конце оправы призмы. В последней конфигурации, для воссоединения волновых фронтов от всех объективов, установленных в револьверном держателе микроскопа, используется единственная призма Номарского, хотя в микроскопах многих конструкций при больших увеличениях требуется выполнять перемещение этой призмы вдоль оптической оси, чтобы компенсировать смещение задней фокальной плоскости объектива.

На рисунке 7 представлена типичная конструкция инвертированного микроскопа для исследований по методу дифференциально-интерференционного контраста с использованием компенсатора Сенармона. Полукогерентные световые волны, излучаемые галогенной лампой с вольфрамовой нитью, расположенной в стойке осветителя, сначала проходят через каскад фильтров (нейтральных, цветокорректирующих и интерференционных), после чего отклоняются прямоугольной призмой и, через полевую линзу, попадают в конденсорную систему. Наверху конденсора установлен компенсатор Сенармона (см. рисунок 8), состоящий из линейного поляризатора и четвертьволновой пластинки. Прошедший через компенсатор Сенармона свет фокусируется в плоскости апертурной ирисовой диафрагмы конденсора (в месте расположения фокальной плоскости конденсора), которая является сопряженной с интерференционной плоскостью призмы Номарского, установленной в головке конденсора (рисунок 8). Линзовой системой конденсора расщепленные волновые фронты фокусируются параллельно друг другу и освещают образец, после чего собираются передней линзой расположенного под предметным столиком объектива.

Вторая призма Номарского (см. рисунок 7) установлена под объективом в револьвере микроскопа, и предназначена для воссоединения расщепленных волновых фронтов, прошедших через образец и сфокусированных объективом. Далее, воссоединенные волновые фронты проходят через второй поляризатор (анализатор; см. рисунок 7), установленный (в скользящей оправе) в промежуточном тубусе или в щелевом гнезде между револьверным держателем и основанием микроскопа. Выйдя из анализатора, волновые фронты (которые теперь способны к усиливающей и ослабляющей интерференции) проходят через внутреннюю оптическую систему микроскопа и формируют изображение в плоскости нерегулируемой диафрагмы окуляров, либо проекционной линзы традиционной или цифровой фотокамеры.

Рис. 8. Конденсор с компенсатором Сенармона для инвертированного ДИК-микроскопа

Как уже упоминалось, в микроскопах, предназначенных для исследований по методу дифференциально-интерференционного контраста и оснащаемых компенсатором Сенармона используются неподвижные призмы Номарского, которые устанавливаются в оправы, аналогичные показанным на рисунке 4. Фазовый сдвиг вносится в оптическую систему поворотом поляризатора в компенсаторе Сенармона, соединенного с конденсором (рисунок 8). Конденсорные призмы Номарского устанавливаются в блоке конденсора, конструкция которого аналогична конструкции блока конденсора прямых микроскопов (см. рисунок 3), но в оправе иной конструкции. Как и в случае с прямыми микроскопами, конденсорные призмы Номарского подходят к узкому диапазону числовых апертур объективов, поэтому, для охвата всего диапазона коэффициентов увеличения микроскопа требуется несколько различных конденсорных призм (см. таблицу 1).

Конденсорные призмы (обычно, круглой формы), при помощи оптического клея, устанавливаются с прецизионной ориентацией оси сдвига в алюминиевые клинья галетной формы, которые крепятся винтами в блоке конденсора. Как и в случае прямых микроскопов, конденсорные призмы Номарского для инвертированных микроскопов чрезвычайно тонки, и вырезаются с очень высокой точностью, с тем, чтобы значения углового разделения точно соответствовали числовой апертуре конкретного объектива. Блок конденсора позволяет установить от трех до пяти призм, что достаточно для охвата всего диапазона коэффициентов увеличения микроскопа. В дополнение к призмам Номарского, в блок конденсора могут устанавливаться фазовоконтрастные кольцевые диафрагмы и щелевые диафрагмы для модуляционного контраста Хоффмана. Кольцевые диафрагмы, щелевые диафрагмы и призмы Номарского могут устанавливаться в конденсор в любых комбинациях.

Компенсационные пластинки первого порядка

Микроскопия по методу дифференциально-интерференционного контраста с компенсатором Сенармона позволяет создавать фазовый сдвиг в диапазоне «плюс-минус половина длины волны». С целью увеличения разности оптических путей расщепленных волновых фронтов, в оптическую систему можно установить пластинку, создающую фазовый сдвиг в целую длину волны, (и получить значения замедления волнового фронта, до полутора раз превышающие длину волны зеленого света). Компенсационные пластинки обеспечивают более полный контроль при регулировке контраста деталей исследуемого образца по отношению к интенсивности и цвету фона, а также позволяют более точно настраивать значение фазового сдвига волновых фронтов. Кроме того, полноволновые компенсаторы часто используются для оптического окрашивания сравнительно толстых прозрачных образцов, которые при нормальных условиях видны в ограниченном диапазоне оттенков серого цвета.

В оптическую систему прямого или инвертированного микроскопа, оснащенного компенсатором Сенармона для ДИК-наблюдений полноволновая компенсационная пластинка может устанавливаться между призмой объектива и анализатором, либо между компенсатором Сенармона и призмой конденсора. Обычно, под конденсором или в промежуточном тубусе, расположенном над объективами прямого микроскопа, имеется щелевое гнездо для установки полноволновой пластинки. Из-за конструктивных особенностей инвертированных микроскопов, возможности установки в них дополнительных компенсаторов более ограничены. В щелевое гнездо, расположенное под корпусом компенсатора Сенармона в конденсоре инвертированного микроскопа (см. рисунок 8), можно установить полноволновую замедляющую пластинку. Однако, конструкция такого микроскопа не позволяет устанавливать дополнительные компенсаторы между объективом и анализатором. Большинство конденсоров для инвертированных микроскопов, предлагаемых другими производителями, имеют аналогичную конструкцию.

В заключение необходимо отметить, что компенсаторы Сенармона предоставляют более широкие возможности для контроля над волновым сдвигом в ДИК-микроскопии, чем традиционные конструкции, работающие по принципу перемещения призмы Номарского поперек оптической оси микроскопа. Соединение градуированного поляризатора (или анализатора) с четвертьволновой пластиной позволяет с высокой точностью определять значение волнового сдвига, вносимого в оптическую систему. И, наконец, конструкции, в которых компенсатор Сенармона располагается вблизи полевой линзы в основании микроскопа, более эргономичны, чем традиционные конфигурации.

Немного о принципе ДИК

Эти призмы состоят из двух склеенных между собою прямоугольных призм, изготовленных из кристаллов, обладающих двойным лучепреломлением (исландский шпат, природный кварц). Призмы склеены таким образом, чтобы их оптические оси были взаимно перпендикулярны. Луч света, падающий на боковую грань одного кристалла, разделяется на два плоско поляризованных луча — обыкновенный и необыкновенный, распространяющихся в таком кристалле с различными скоростями. Попадая во вторую призму под другим углом к направлению оптической оси второго кристалла, они преломляются у поверхности раздела двух склеенных кристаллов под различными углами (при этом обыкновенный луч становится необыкновенным и наоборот). Выходя из второго кристалла наружу, каждый из двух лучей снова преломляется, почти симметрично отклоняясь один от другого в разные стороны от направления луча, входящего в первую призму. Визуально этот принцип выражается в том, что поверхности образца освещается поляризованным монохроматическим светом, т.е. имеющим определенную длину волны (= окраску синим или красным, или зеленым и т.д.). Если поверхность образца совершенно плоская, то она вся окрашивается одинаково. При горизонтальном перемещении призмы цвет плоской поверхности будет изменяться в соответствии со схемой, приведенной на рис.4. ( Цветная шкала приведена здесь для наглядности и не соответствует шкале интерференционных цветов) Горизонтально перемещая призму, мы видим поверхность сначала, например, желтой, потом зеленой и т.д.

Рисунок 4. Схема окрашивания поверхности образца в методе дифференциально-интерференционного контраста.

Рисунок 5. Фрагмент шкалы объект-микрометра (а) и изображение криволинейной поверхности (б) при использовании метода дифференциально-интерференционного контраста.

Визуализация поверхности покрытий с применением дифференциально-интерференционного контраста

На рисунке 7 приведена поверхность покрытия нитрида титана, нанесенного на подложку из нержавеющей стали. Применение дифференциально-интерференционного контраста при различных увеличениях позволяет выявить неровности поверхности, которая в светлопольном изображении воспринимается практически ровной (рис.7,а,в). При увеличении 200х в светлом поле хорошо видны темные полосы на поверхности покрытия. Поперечный рельеф заметен плохо (синие стрелки на рис. 7,а). Поперечный рельеф выявляется в ДИК (желтые стрелки на рис. 7,б). При повышении увеличения до 400х на светлопольном изображении поперечный рельеф также плохо различим (стрелка на рис. 7, в); наиболее глубокие линии рельефа проявляются в ДИК в виде темных полос (рис. 7,г).

Рисунок 7. Визуализация поверхности методом дифференциально-интерференционного контраста.

На рисунке 8 представлен дефект пленки углерода на монокристаллической пластинке кремния Si (111) при увеличении 2000х с применением дифференциально-интерференционного контраста. Различие в цвете отдельных участков поверхности обусловлено их различной высотой, за счет чего и проявляется эффект окрашивания. Дефект обусловлен отслоением покрытия от поверхности детали.

Рисунок 8. Дефект пленки; дифференциально-интерференционный контраст, монтаж из 4 фрагментов; х2000.

Под призмой Номарского понимают модификацию призмы Волластона. Классическая призма Волластона состоит из двух призм одного размера с сечением в виде прямоугольного треугольника. Одна из них делается из двулучепреломляющего материала (например, из исландского шпата), а вторая из стекла с показателем преломления, близким к среднему значению показателя преломления материала первой призмы. Пучок излучения падает нормально на большую катетную грань стеклянной призмы, проходит сквозь неё и попадает на гипотенузную грань двулучепреломляющей призмы. В отличие от призмы Глана, оба пучка с ортогональными поляризациями проходят через эту призму и выходят из неё под разными углами.

Призма Номарского изготавливается из двух двулучепреломляющих призм (в этом случае чаще используется кварц), в которых оптическая ось первого клина составляет со входной гранью некоторый угол и перпендикулярна ребру клина, а оптическая ось второго клина параллельна ребру клина. При этом катетные ребра треугольного сечения обеих призм, направленные вдоль оси системы, весьма малы (в 7—10 раз меньше двух других ребер), что обеспечивает возможность локализации интерференционных полос вне призмы (см. рисунок), что позволяет легко настроить микроскоп.

3) Два луча сфокусированы с помощью собирающей линзы перед проникновением в образец. Лучи сфокусированы так, что они проходят через две соседние точки образца, расстояние между которыми приблизительно 0.2 μm.

Таким образом образец освещен двумя лучами, один из которых имеет поляризацию 0°, а другой 90°. Путь, проходимый одним лучом, слегка отличается от пути, который проходит второй луч.

Путь света через ДИК-микроскоп

1) Исходно неполяризованный свет попадает в микроскоп и из него выделяется линейно поляризованное излучение, плоскость поляризации которого наклонена на 45° к оси рисунка.

2) Поляризованный свет входит вначале в призму Номарского и разделяется на два пучка, плоскости поляризации которых взаимно ортогональны.

Методики контрастирования при работе с микроскопом

При работе с микроскопом исследователи часто сталкиваются с низким контрастом изображения в окулярах и на фотокамере. Иногда крайне затруднительно различить мельчайшие дефекты на кремниевой пластине или определить рельеф поверхности образца. Причин может быть несколько, но в основном это несоответствие условий освещения задачам наблюдения. В этой статье речь пойдет о повышении информативности изображения при использовании специальных фильтров и оптических компонентов, меняющих природу формирования изображения. Мы рассмотрим методики контрастирования на микроскопах отраженного и проходящего света, подробно отразив схемы хода лучей.

Поляризация

Поляризация – широко применяющийся метод контрастирования, меняющий физику изображения. Этот метод позволяет убрать блики поверхностей с высоким коэффициентом отражения, получить качественное и насыщенное изображение, но главное – с поляризацией возможно проведение петрографических исследований и измерений углов поляризации для определения состава объекта. Для проведения поляризационных исследований необходимо два компонента – поляризатор (обычно неподвижный) и анализатор (обычно вращаемый). Два фильтра (поляризатор и анализатор), введенные последовательно в ход лучей и повернутые относительно друг друга на 90 градусов, не пропускают свет. Первый фильтр изменяет плоскость поляризации света таким образом, что пропущенный им свет не может пройти через второй фильтр (анализатор). Реализация поляризованного освещения в микроскопе достаточно простая задача. При работе с проходящим светом поляризатор устанавливается в конденсор, а анализатор находится за объективом. В отраженном свете анализатор остается на своем месте, а поляризатор устанавливается перед дихроичным зеркалом сразу после апертурной диафрагмы осветителя отраженного света. В обоих случаях образец освещается плоскополяризованным светом. Если образец при освещении поворачивает направление колебаний поляризованного света из плоскости заданной поляризатором, то в окулярах мы начинаем видеть свет, который частично пропускает анализатор. Явление поляризации характерно прежде всего для таких кристаллов как минералы, а также для полимеров.

Поляризация в отраженном свете.1 — осветитель, 2 — поляризатор, 3 — дихроичное зеркало, 4 — объектив, 5 — образец, 6а — лямбда-пластина, 6 — анализатор, 7 — тубусная линза

Поляризация в проходящем свете.1. поляризатор, 2 — конденсор, 3 — образец, 4 — объектив, 5а — лямбда пластина, 5 — анализатор, 6 — тубусная линза

Обычно в оптический путь перед анализатором вводят компенсатор «Лямбда-пластину» (иногда его называют красной пластиной первого порядка). Линейно поляризованный луч в кристалле компенсатора раскладывается на 2 луча: обыкновенный и необыкновенный, близкие по интенсивности. При выходе из компенсатора необыкновенный луч получает запаздывание на одну длину волны относительно обыкновенного. Но поскольку обыкновенный и необыкновенный лучи поляризованы по-разному, то интерферировать они не могут. Пройдя анализатор, установленный перпендикулярно поляризатору, оба луча будут ослаблены наполовину, но их плоскости поляризации теперь совпадут. Лучи интерферируют, и, в результате, поле зрения окрашивается в розово-красный цвет (как правило разность хода волн в компенсаторе порядка 580 нм). Если между поляризатором и компенсатором окажутся оптически-активные включения, то для прошедших через них лучей условия интерференции будут другими, и изменится их цвет. То есть компенсатор осуществляет цветовое контрастирование оптически-активных объектов. Углом поворота компенсатора можно в определенной мере менять цвет фона и «раскраску» объектов, но при угле 45 градусов относительно поляризатора и анализатора будет получена максимальная интенсивность.

Механические напряжения в стекле приводят к двулучепреломлению, оказывающему воздействие на поляризованный свет. Часто для проведения количественных поляризационных исследований используют специальные объективы, не обладающие внутренними напряжениеями, они имеют маркировку Pol.

Фазовый контраст

Фазовый контраст используется в основном в биологии для изучения живых неокрашенных клеток. Метод основывается на разности оптической плотности (показателя преломления) разных частей наблюдаемого объекта, а также среды, в которую образец заключен. Например, упрощенно рассматривая клетку, расположенную в водном растворе, мы сможем выделить три зоны: А (водный раствор), В (цитоплазма) и С (ядро).

Метод фазового контраста в проходящем свете.1 — фазовая вставка в конденсор, 2 — линза конденсора, 3 — образец, 4 — объектив, 5 — фазовое кольцо в объективе, 6 — лучи со сдвигом фазы, 7 — луч без запаздывания

Световые волны незначительно смещаются, проходя через различные среды, из-за разности показателя преломления. Причем, помимо геометрического смещения, происходит явление запаздывания — смещение фазы. До прохождения через препарат волны света находятся «в фазе», а после прохождения через различные материалы — уже нет. Величина фазового смещения будет зависеть от оптической плотности материалов, а также от величины пути в этих средах. Наш глаз не может заметить разность фаз в изображении. Он различает только разницу интенсивности и разницу цвета. Метод фазового контраста позволяет преобразовать значения фазового сдвига в значения интенсивностей света.

В конденсор микроскопа вставляется специальная фазовая вставка (кольцевая диафрагма, схожая с темнопольной вставкой). Свет, прошедший через нее, формируется конденсором и освещает препарат. Весь пучок света поступает в объектив и в зрачке объектива формируется изображение фазовой вставки. В этом месте в объективе расположено нанесенное на стекло фазовое кольцо — оптический материал, снижающий интенсивность излучения и придающий свету постоянное фазовое смещение. Если в препарате содержатся объекты, изменяющие направление луча (как клетки и их ядра), то свет из прямого луча отклоняется на новую траекторию. Этот свет не проходит сквозь фазовое кольцо, не ослабляется и не задерживается. Все частичные лучи объединяются тубусной линзой и формируют промежуточное изображение.  В нем частичные лучи, поступающие с различными фазами, ослабляются или усиливаются, накладываясь друг на друга. Таким образом, разность фаз превращается в разницу интенсивностей, которую может регистрировать наш глаз.

Метод фазового контраста незаменим при работе с живыми клетками, проведении ЭКО, различных манипуляциях с неокрашенными препаратами.

Темное поле/косопадающий свет

При освещении объекта коаксиальным светом через объектив очень сложно оценить топографию поверхности объекта или микродефекты образца из-за отсутствия теневых областей. Иногда бестеневое освещение необходимо (в случае реставрационных работ под стереомикроскопом или при проведении каких-либо хирургических операций), но в случае, когда нам необходимо определить рельеф поверхности, тени – единственное, за что сможет зацепиться наше зрение. Для того, чтобы создать рельефную контрастную картину, необходимо осветить объект сбоку так называемым косопадающим светом. На стереомикроскопе при помощи специальных осветителей типа «гусиная шея» сделать это не составит труда, в то время как на лабораторном микроскопе крошечное рабочее расстояние объектива не позволит вводить источник света сбоку. На помощь в таком случае нам придут темнопольные объективы (индекс BD – Brightfield/Darkfield).

Темное поле в отраженном свете.1 — осветитель отраженного света, 2 — система конических зеркал, 3 — наклонное кольцевое зеркало, 4 — темнопольный объектив, 5 — образец на предметном столе

Такие объективы обладают дополнительным металлическим цилиндром снаружи, являющимся проводником и отражателем света. Свет не попадает через объектив непосредственно в поле зрения, но попадает через полый цилиндр на поверхность образца вне поля зрения, и, отражаясь от нее, обеспечивает предельно косопадающее освещение видимой области. Микрочастицы, расположенные на ровной поверхности образца, начинают светиться, трещины и прочие дефекты резко подчеркивают грани. При работе в проходящем свете достаточно воспользоваться темнопольной вставкой в конденсор — метод А. При работе с объективами с высокой числовой апертурой необходимо использовать диафрагму, отрезающую проходящий свет из конденсора — метод B.

Темное поле в проходящем свете. ( Метод А: темнопольная вставка в конденсоре)1 — вставка в конденсор, 2 — конденсорная линза, 3 — образец, 4 — объектив

Темное поле в проходящем свете. ( Метод В: апертурная диафрагма объектива с высокой NA, отрезающая проходящий свет)1 — темнопольная вставка в конденсор, 2 — конденсорная линза, 3 — образец, 4 — объектив, 5 — апертурная диафрагма

Оптический путь ДИК-микроскопа

4) Лучи проходят через две соседних области образца. Таким образом, они проходят разные оптические пути, на которых образец имеет различную толщину и различные показатели преломления. Оптическая плотность, пройденная первым лучом, отлична от плотности, пройденной вторым лучом, это является причиной изменения фазы одного луча относительно другого.

Проникновение пар лучей через пары соседних точек образца формируют изображение. Возникает множество ярких изображений, слегка смещенных друг относительно друга. Кроме видимой человеческому глазу, свет переносит также невидимую глазу информацию о фазе света. Это очень важно впоследствии. Различие в поляризации света сохраняет интерференцию между двумя картинками в выбранной точке.

5) Далее два пучка попадают в объектив, где они встречают на своем пути вторую призму Номарского.

6) Вторая призма соединяет два пучка в один с поляризацией, наклоненной на 135° по отношению к плоскости рисунка. Комбинация двух лучей приводит к интерференции, затемненное или более яркое изображение в точке является результатом разности оптических путей двух лучей.

Призма накладывает два ярких поля одно на другое и выравнивает их поляризацию так, чтобы два луча интерферировали. Из-за различной степени освещения изображения не перекрывают друг друга полностью, то есть вместо того, чтобы интерферировать с лучом, проходящим через ту же точку, первый луч будет интерферировать с лучом, проходящим через соседнюю точку и имеющим другую фазу. Так как различие оптических путей порождает различие фаз, комбинация лучей является «оптическим дифференцированием» и приводит к возникновению видимого изображения.

Какой микроскоп нужен для биологии?

Начнём с самых простых задач, для которых понадобится лабораторный прямой микроскоп, например, Olympus CX43. Используется для исследований: анализа спермы (клеточных элементов эякулята), неклеточных элементов, осадка мочи, нативных препаратов крови, активного ила, поперечных срезов филаментов, микрофлоры в мазках, планктона и список можно продолжать до бесконечности.

Рисунок 1. Примеры снимков на LC30 с микроскопа CX43

Область применения микроскопа в биологии зависит от коррекции объективов. Обратите внимание на снимки снизу. На фотографиях ниже запечатлены водоросли. Съёмка проводилась через планахромат PLAN C.

Рисунок 2. Сравнение объективов с коррекцией планахромат и ахромат

А что будет, если установить биологические объективы PLAN C в микроскоп классом выше, например, BX43? Посмотрите на рисунок снизу, сразу станет понятно, что для большей детализации, нет необходимости сильно закрывать диафрагму и терять в освещённости.

Рисунок 3. Olympus PLAN 20x NA=0.40 в BX43

Для серьёзных биологических исследований, флуоресценции и ДИК используйте исследовательские микроскопы

Прямую компоновку предпочтительно применять биологам, занимающимися флуоресцентными наблюдениями. Разберём по порядку. Флуоресценция применяется для анализа, меченных флуорофором, участков молекул, наблюдения и регистрация сегментов хромосом. Преимуществ много, специфичность высокая и для пропускания УФ излучения требуется низкодисперсное стекло или кристаллы. Раньше использовали кристаллы флюорита, из-за чего класс оптики получил своё наименование – Fluorite. Сложная оптика дополняется непростой системой фильтров, позволяющих рассматривать образцы, окрашенные несколькими красителями одновременно. Для достоверных результатов необходимо равномерное освещение образца, обеспечивающее одинаковую резкость по всему полю зрения. Такую равномерность обеспечивают линзы структурно похожие на пчелиные соты.

Дифференциально интерференционный контраст (ДИК) в биологии

Это интересная современная разработка, передающая псевдорельеф изображения. Если Вы никогда раньше не использовали этот контраст, то представьте совмещение поляризации и фазового контраста. Получаемые окрашенные изображения, дают ценную информацию при исследовании живой материи. Из-за поляризационной картины напряжений не стоит применять пластиковую посуду, искажающую его, гораздо лучше подойдёт стекло. Дополнительные компенсаторы, λ-пластинки, могут усиливать, либо ослаблять рельефность изображения.

Поляризационные биологические исследования

Поляризацию используют во множестве прикладных наук, в том числе – биологии. Основные приёмы работы нужно почерпнуть из пособий по кристаллографии. Применяется для поиска оптических неоднородностей, определения стороны поляризации, диагностики кристаллов. Конкретика: для анализа подагры применяют поворотный поляризатор, λ пластинку и поворотный анализатор. Диагностируется болезнь по наличию кристаллов урата, с характерным негативным двулучепреломлением и свечением в скрещенных николях (поляризаторе/анализаторе). Есть специальные анализаторы для CX43 с U-GAN, где не требуется дополнительная λ пластина и вам необходимо вращать только поляризатор. Это значительно экономит время и снижает требования к специалисту. Это частный пример определения концентрации оптически активных веществ в биологических растворах, не менее распространено определение минералов примесей в растительном сырье. Для сложных почвенных экспертиз пользуются BX53P, это биологический современный поляризационный микроскоп с ортоскопией и коноскопией. Коноскопия – поляризационные наблюдения в сходящемся свете, прекрасно подойдёт, если необходимо диагностировать минералы в почве, потому что при скрещивании анализатора и поляризатора, лучи, прошедшие через линзу Бертрана, не дают картинку минерала, а представляет интерференционные эффекты, коноскопические фигуры, по которым определяют количество осей, оптический знак, относительную величину угла между оптическими осями.

По необходимым компенсаторам и поляризаторам Вы можете получить бесплатную консультацию у наших специалистов.

Тёмное поле, используемое биологами

Недорогой и эффективный способ выявления оптически активных объектов. Основан на освещении образца полым конусом света, не отражающимся в объектив. Наблюдатель видит только рассеянное от образца картинку. Таким образом можно заметить прозрачные объекты. Одной из разновидностей методик применяющей такое контрастирование, является ультрамикроскопия, при которой препарат освещается мощным потоком фотонов сбоку. Главное преимущества этого освещения: выявление частиц, размером меньше длины волны видимого спектра. Биологи, в частности ветеринары, применяют его для диагностики лептоспироза.

Рисунок 4. Treponema pallidum в тёмном поле

Фазовый контраст – нестареющая классика

С момента своего появления, самый распространённый метод контрастирования среди биологов. Бактериологи без окраски видят контуры прокариотов, работники санитарных экспертиз легко находят и диагностируют простейших, в КДЛ давно используют PH для оценки качества спермы. Тысяча применений, но настройкой этого контраста хотят заниматься не многие, и для них Olympus сделал прецентрированный фазовый контраст, реализованный в CKX53.

Инфракрасная микроскопия (ИК)

Перспективна для гематологических исследований. Сейчас тестируются ИК определение заболеваний кишечника, содержание многих метаболитов, образованных патологическими изменениями в организме, определение ангины по капле сыворотки крови пациента. Это один из спектрометрических методов исследований основанный на оценке соотношения поглощения-испускания-рассеяния инфракрасного спектра веществами. На макроуровне, с применением MVX10 или SZX16, можно оценивать особенности формирования семян, содержания различных веществ в тканях растений без необходимости их химического анализа.

Как сейчас выбрать биологический лабораторный микроскоп

Сначала определите какой штатив Вам подходит больше. Если Вы будете просматривать объекты прямо в лабораторной посуде (чашках Петри, планшетах, колбах, флаконах), то приобретайте инвертированные микроскопы, если же Вам необходимо большое увеличение и контроль морфологии мелких биологических структур, то выбирайте прямой микроскоп. Обозначьте необходимые методы исследований: дифференциальное окрашивание, ДИК, поляризация (простая или количественная, ортоскопия или коноскопия), dark field (нужна ли ультрамикроскопия с кардиоидным конденсором, либо достаточно NA=0,6). Подберите подходящую оптику, которая должна соответствовать не только предполагаемому контрастированию, но и качеству изображения, которым Вы будете довольны. Приведём классификацию ниже:

Монохроматы – объективы, с исправленными аберрациями для одной длины волны или очень узкой спектральной области, исправлены сферические искажения, кома и астигматизм. Ахроматы исправлены по двум длин волн (узких спектральных диапазонов), скорректированы по: сферические искажения, коме, астигматизму, хроматичезмы положения и, частично, сферохроматические ошибки. Предназначены для работы в спектральной области от линии F (λ=486нм) до C (λ=656нм). У апохроматов коррекция расширена и распространяется на три длины волны, исправлены: вторичный спектр и сферохроматические отклонения, благодаря наличию особых линз и кристаллов с особым ходом частных относительных дисперсий. Распространены половинные решения, такие как полуапохроматы, полуахроматы, которые могут называться иначе: планфлуориты, план С.

План делятся на планахроматы (PLN), планполуапохроматы (UPLFLN) и планапохроматы (PLAPON). они аналогичны соответствующим ахроматами и прочим, но в них существенно лучше исправлены кривизна поверхности и астигматизм, а волновые аберрации в пределах всего поля не превышают 0,5λ.

Выбор конденсора очень важен для биологического микроскопа, потому что от этого также зависит разрешающая способность всего микроскопа

Конденсоры, как и остальная оптика, подразделяются по степени коррекции аберраций, рабочему расстоянию, числовой апертуре и дополнительным вставкам для контраста. Это очень важный модуль микроскопа, от этого зависит равномерность освещения образца. Этот компонент недооценивается многими потому, что в школьных микроскопах на уроках биологии он отсутствует, есть лишь зеркало и отверстие в столике, но для себя, необходимо сравнить картины, получаемое без конденсора, и с ним. Дело в том, что некогерентный и ненаправленный свет от лампы, распространяется во всех направлениях, частично отражаясь и рассеиваясь, а значит на предметное стекло, попадает, не более 15-20%. Именно электромагнитные волны формируют картинку, и от их количества зависит разрешающая способность всей системы. Апертура – это угол, под которым линза собирает или испускает лучи, если у конденсора она выше, чем у объектива, то лучи, проходящие мимо детектора просто засоряют рисунок. Когда происходит обратное, у чечевиц NA выше, они не раскроют весь свой потенциал.

Заключение

Значимость микроскопии в биологических лабораториях трудно переоценить. Основные направления развития: новые способы контрастирования, селективные флюорофоры, спектрометрические методы, линзы сверхвысокого разрешения, съёмка на камеры с высокими выдержкой или фреймрейтом. Вплотную к оптическому пределу подошли конфокальные системы, а атомно-силовые микроскопы (АСМ) даже преодолели его.