Прибор пишет спектр от 220 до 800 через 1 нм автоматом, возбуждение же идет только на одной длиннее волны, заданной пользователем. Использовал 220 нм для возбуждения, так как мои вещества флюоресцируют плохо, а эта максимальная энергия для прибора. Про множественность максимумов поглощения вы ерунду написали. Во-первых, другой прибор пишет спектры поглощения от 200 до 350 и от 350 до 800 автоматом через 1 нм. Во-вторых, количество максимумов в спектре поглощения соответствует количеству электронных переходов, а это в среднем несколько сотен. Другое дело, что большинство из них высокоэнергетические и находятся при длинах волн меньше 200 нм. Прочие (ок десятка) сливаются в 2-4 максимума, так как съемку осуществляли при комнатной температуре, а не при абсолютном нуле. О каком эталоне речь? По какому призану он эталон?
Вы спрашиваете, про оптимальную длину волны, я отвечаю как её искал я. Речь идет о применении флуоресценции для качественного определения, каких то светящихся компонентов в исследуемом образце. Например, хочется мне компоненты лекарственной смеси определить, количественно ну и качественно( захотелось вот сильно). Смотрю что для некоторых веществ у меня максимумов люминесценции нет, никто не померил. Я беру это чистое вещество и начинаю у него находить максимум, сканирую, сканирую, сканирую. Причем одновременно сканирование идет по двум длинам волн: возбуждения и регистрации. Нахожу, окей. Беру делаю пробоподготовку и бухаю в кювету раствор моей лекарственной смеси. И начинаю,сканировать. Хлоп есть максимум четкий, соответствующий моему веществу, ну и там в дальнейшем градуировка и все такое. То есть про эталон я имел ввиду только в рамках аналитической задачи. Вот. Почему я затронул про примеси тему? Да потому что при измерении некоторых вещей, казалось бы чистых, у меня наблюдалось N-ое количество пиков(максимумов) всевозможных, как потом подтвердилось другим методом, эти максимумы соответствуют примесям
Вот от чего я в полнейшем шоке, так это от варианта «В линейный размер (максимальный габарит молекулы)»
Какие вообще основания для для включения его в опрос?
Вообще-то, длина молекул полимеров может достигать сантиметров (Вы будете облучать их радиоволнами?).
Устный доклад представленный на конференции (не мной).
Да и почему именно 220 нм, тоже непонятно. Если только как стандарт, для одинаковости условий?
Я бы лично порекомендовал настраиваться на максимум поглощения. Разумеется, если он один. Но нередко бывает (я бы даже сказал — довольно часто), что в спектре поглощения наличествуют несколько максимумов, отвечающих переходам в различные возбуждённые состояния (термы). Просто из-за уширения они частично перекрываются, образуя широкий модулированный контур. И вот тут можно очень сильно наколоться: в зависимости от того, куда вы конкретно настроитесь, результаты могут довольно сильно отличаться. Так что, если подходить с позиций чистой науки, необходимо прописывать спектр перестаиваемым источником возбуждения.
Разумеется, если вы работаете с известным веществом, обладающим в исследуемой области единственным изолированным переходом в возбуждённое состояние, то задача упрощается, и тогда особой разницы, чем возбуждать, нет.
С ферроценом такой проблемы нет. Незамещенный ферроцен дает относительно узкую полосу УФ поглощения высокой интенсивности при 225 нм . Мои же вещества имеют максимумы 224-235 нм. Это точно ферроценовый фрагмент. Хотя да не для всех эти максимумы глобальны, те есть еще лучше УФ поглощающие фрагменты, но их максимумы не рядом с ферроценом и не мешают.
Я органик, а не физхимик. То есть я не обязан знать регламент поглощения-эмиссии УФ. Потому в след за большинством записал спектры флоурисценнции при возбуждении 220 нм. Теперь вот думаю, а не переснять ли их на длинах волн поглощения фероценового фрагмента.
А что это, интересно, за химики, обсуждающие на конференциях такие вопросы?
Разные. Секции конференции:
1. Неорганическая и аналитическая химия:
– неорганический синтез;
– химия координационных соединений;
– анализ объектов неорганического происхождения;
– химия окружающей среды.
2. Органическая химия:
– органический синтез;
– химия полимеров;
– химия природных соединений;
– анализ объектов органического происхождения.
3. Физическая химия:
– электрохимические исследования;
– физическая химия неорганических и органических систем;
– квантово-химические методы исследования.
Походу еще вопрос возник. Что за относительные единицы? Физ смысл у них какой? Отношение чего к чему? Знаю, что в УФ спектрах поглощения это отрицательный натуральный логарифм отношения мощностей световых потоков. А в спектрах фотолюминесценции что это?
Спектр
испускания представляет собой зависимость
интенсивности испускания от длины
волны (или волнового числа) при
фиксированной длине волны возбуждающего
света. При
строгих количественных измерениях
спектры.
Форма
спектра испускания флуоресценции обычно
не зависит от длины волны возбуждающего
света, поскольку испускание практически
всегда происходит с нижнего колебательного
подуровня возбужденного электронного
состояния. Если вид спектра флуоресценции
меняется с изменением длины волны
возбуждающего света, это может быть
следствием того, что в смеси содержится
несколько флуоресцирующих компонентов.
Интенсивность
флуоресценции пропорциональна
концентрации флуоресцирующего вещества.
Поэтому измерения флуоресценции можно
использовать для определения концентраций.
Минимальные измеряемые концентрации
составляют около 10-12
г/литр, т.е. этот метод в 100-1000 раз
чувствительнее, чем абсорбционная
спектроскопия.
Спектром
возбуждения называют зависимость
интенсивности испускания флуоресценции
от длины волны (или волнового числа)
возбуждающего света при постоянном
потоке фотонов, падающих на образец.
Важно, что длина волны испускания при
регистрации спектра возбуждения остается
неизменной, а значения длины волны
возбуждения (волновых чисел линии
возбуждения) пробегают значения заданного
диапазона. Измеряемой величиной является
интенсивность испускания флуоресценции,
но в спектре ось ординат называют
интенсивностью возбуждения флуоресценции.
При
измерениях спектра возбуждения должно
быть соблюдено условие постоянства
потока фотонов возбуждения, попадающих
на образец, независимо от длины волны
возбуждения. Так как не существует
источников света с постоянной по длине
волны интенсивностью излучения, идеальный
флуориметр должен компенсировать
изменение интенсивности возбуждающего
света с длиной волны.
В
современных приборах такая процедура
осуществляется следующим способом.
Небольшая часть возбуждающего света
после прохождения монохроматора
возбуждения отклоняется в сторону с
помощью делительной пластинки, и ее
интенсивность регистрируется
дополнительным детектором (фотодиодом
или ФЭУ). Зарегистрированный сигнал
(интенсивность испускания на фиксированной
длине волны) с основного детектора (как
правило, это ФЭУ) нормируется на
интенсивность возбуждающего света по
результатам измерения дополнительного
детектора.
В
начале ХХ века трудами Леона
Бриллюэна
и Леонида
Исааковича Мандельштама
было найдено, что интенсивность света,
рассеянного ансамблем макромолекул,
должна быть промодулирована спонтанными
флуктуациями плотности. В 1964 году Р.
Пекора теоретически показал, что в
оптическом спектре излучения света,
рассеянного диффундирующими частицами,
содержится информация как о трансляционной,
так и о вращательной диффузии. С
использованием лазеров и быстродействующих
временных анализаторов интенсивности
света (корреляторов) в практике
молекулярной биологии появилась
возможность методом динамического
рассеяния света (ДРС) в считанные минуты
опрeдeлять коэффициенты поступательного
трения. Было показано, что коэффициeнты
вращательного трения очень асимметричных
молекул и спектр мод внутренних движений
гибких молекул могут быть определены
методом ДРС в том случае, если их размеры
сравнимы с длиной волны света. Кроме
того, эффективность примeнeния этого
метода сильно возрастает по мeрe увeличeния
молекулярной массы изучаемой молекулы.
В методе локализованного ДРС лазерный
пучок фокусируется на одиночной частице
микронных размеров. Спектр колебаний
такой одиночной частицы во времени и
его изменение под действием сил различной
природы может быть изучен методом
временных корреляционных функций.
ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ (от лат. lumen, род. падеж luminis -свет и -escent — суффикс, означающий слабое действие), свечение в-ва, возникающее после поглощения им энергии возбуждения. Представляет собой избыток над тепловым излучением, испускаемым в-вом при данной т-ре за счет его внутренней (тепловой) энергии. В отличие от др. видов свечения (напр., рассеяния света, тормозного излучения) люминесценция характеризуется временем свечения, значительно превышающим период колебаний световой волны и составляющим от 10-12 с до неск. суток. Понятие люминесценции применимо только к такому в-ву (совокупности частиц), состояние к-рого не слишком отличается от термодинамически равновесного, иначе различие между люминесценцией и тепловым излучением теряет смысл.
Механизм люминесценции заключается в образовании под действием энергии от внеш. или внутр. источника возбужденных состояний атомов, молекул, кристаллов и послед. испускании ими квантов света (фотонов). По типу возбуждения выделяют фотолюминесценцию (источник энергии возбуждения — свет), радиолюминесценцию (радиоактивное излучение), рентгенолюминесценцию (рентгеновское
излучение), электролюминесценцию (электрич. поле), катодолюминесценцию (пучок электронов), триболюминесценцию (мех. воздействие), хемилюминесценцию (хим. р-ции) и др. Различают молекулярную люминесценцию, при к-рой молекулы или атомы испускают фотоны при переходе из возбужденного состояния в основное квантовое состояние, и рекомбинационную люминесценцию, когда под действием энергии возбуждения образуются носители заряда (электроны и дырки в кристаллофосфорах) или ионы и радикалы (в газах, жидкостях, стеклах), послед. рекомбинация к-рых сопровождается испусканием фотонов. Излучат. переход из возбужденного состояния в основное происходит самопроизвольно (спонтанная люминесценция) или под действием внеш. электромагн. излучения (вынужденная люминесценция). Испускание света может происходить не обязательно теми же молекулами, к-рые возбуждаются при поглощении энергии, но и другими, если происходит безызлучат. передача энергии возбуждения (сенсибилизированная люминесценция). Люминесценция характеризуют спектром испускания (фотолюминесценцию — также спектром возбуждения), квантовым выходом, поляризацией, кинетикой затухания. В данной статье рассматривается мол. фотолюминесценция, к-рую широко применяют в технике и аналит. химии (см. Люминофоры, Люминесцентный анализ), фотохимии и хим. кинетике для изучения св-в возбужденных состояний частиц и очень быстрых хим. р-ций, в фотобиологии, биохимии и медицине для изучения св-в биол. объектов и механизма биол. процессов. О др. видах люминесценции см. Кристаллофосфоры, Рентгеновская спектроскопия, Хемилюминесценция.
Механизм люминесценции. Молекулярную фотолюминесценцию подразделяют на флуоресценцию и фосфоресценцию. Флуоресценция характеризуется малой длительностью (менее 10-6 с) и обусловлена испусканием фотонов при переходе системы из возбужденного состояния той же мультиплетности, что и основное состояние. Фосфоресценция -длит. свечение (от долей до неск. десятков с), к-рое возникает при переходе в осн. состояние из возбужденного состояния иной мультиплетности; такой переход происходит с нарушением спинового правила отбора (см. Квантовые переходы). Для большинства орг. молекул с четным числом электронов осн. состояние является синглетным, а низшие возбужденные состояния имеют мультиплетность 1 и 3, т. е. могут быть синглетными и триплетными. Для таких молекул флуоресценция представляет собой излучат. переход в осн. состояние S0 из возбужденного синглетного состояния S1 (переход 2 на рис. 1).
Рис. 1. Схема квантовых переходов при молекулярной люминесценции. S0 — основной электронный уровень (с колебат. уровнями), S1 и Т1 — возбужденные электронные уровни (синглетный и триплетный соотв.). Прямыми вертикальными стрелками обозначены: поглощение
, излучательные переходы флуоресценция
и фосфоресценция
, горизонтальными стрелками — безызлучат. переходы: интеркомбинац. конверсия
и внутр. конверсия
. Волнистыми стрелками обозначены процессы колебат. релаксации энергии возбуждения.
С флуоресценцией конкурирует
безызлучат. переход в триплетное состояния Т1 с энергией меньшей, чем у состояния S1 (интеркомбинац. конверсия). Фосфоресценция — излучат. переход из ниж. триплетного состояния Т1 в осн. состояние — наблюдается в условиях, когда конкурирующие с данным излучат. переходом безызлучат. процессы замедлены (высокая вязкость в-ва, низкие т-ры и т. п.). Впервые связь фосфоресценции с запрещенным излучат. переходом из триплетного состояния была обоснована А. Н. Терениным (1943).
Возможна и т.наз. замедленная флуоресценция, когда вследствие, напр., термич. активации молекул в возбужденном триплетном состоянии T1 происходит безызлучат. переход в возбужденное синглетное состояние S1 с
послед. испусканием фотона в результате излучат. перехода S1 S0. Спектр замедленной флуоресценции идентичен спектру обычной флуоресценции, но время затухания на неск. порядков больше.
У нек-рых молекул осн. состояние не является синглетным. Так, для О2 осн. состояние триплетное 3; слабая фосфоресценция, наблюдаемая для этого в-ва в ближней ИК области, обусловлена переходом из ниж. синглетного состояния 1 в основное. Для радикалов, имеющих один неспаренный электрон, осн. состояние дублетное (мультиплетность 2), низшие возбужденные состояния имеют мультиплетность 2 и 4 (соотв. дублетные и квартетные состояния). Флуоресценция радикалов наблюдается при переходе из ниж. возбужденного дублетного состояния в основное.
Спектры люминесценции. Спектр испускания (часто наз. просто спектром люминесценции) представляет собой зависимость интенсивности свечения от частоты (длины волны) испускаемого света. В лит. обычно приводят наблюдаемые спектры испускания, зависящие от спектральной чувствительности и градуировки прибора. Для получения истинного (квантового) спектра испускания выражают интенсивность люминесценции в числе фотонов, приходящихся на единичный интервал частот.
Спектром возбуждения люминесценции наз. зависимость интенсивности свечения на фиксированной частоте от частоты (или длины волны) возбуждающего света. Для получения истинного (квантового) спектра возбуждения необходимо учитывать зависимость интенсивности возбуждающего света (выраженной в числе падающих или поглощенных фотонов в единицу времени) от частоты. При слабом поглощении света образцом истинный спектр возбуждения люминесценции в большинстве случаев совпадает со спектром поглощения люминесцирующего в-ва.
Положение (частота) полосы в спектре люминесценции определяется разностью энергий состояний, связанных излучательным переходом; интенсивность полосы и время затухания свечения — заселенностью возбужденного состояния и вероятностью перехода (или временем жизни возбужденного состояния). Как правило, люминесценция происходит при переходе молекулы в осн. состояние S0 с ниж. колебат. уровня первых возбужденных электронных состояний S1 и T1; при возбуждении молекулы в более высокие электронные состояния (S2 и др.) или на верхние колебат. уровни состояний S1 и Т1 избыточная энергия, как правило, релаксирует гораздо быстрее (за время 10-12 с), чем происходит испускание. При испускании фотона сохраняется равновесная ядерная конфигурация молекулы, свойственная возбужденному состоянию (принцип Франка-Кондона), поэтому при возвращении в осн. состояние молекула обычно оказывается на одном из верх. колебат. уровней, соответствующем колебаниям тех хим. связей, равновесная длина к-рых при данном электронном переходе меняется. В результате в колебат. структуре спектров люминесценции мн. молекул проявляются частоты колебаний осн. состояния, тогда как в колебат. структуре спектров поглощения проявляются частоты колебаний возбужденного состояния.
В атомных парах и р-рах нек-рых в-в испускание фотонов происходит при переходе в осн. состояние S0 из того же возбужденного состояния, к-рое образовалось при поглощении фотона; при этом энергии испускаемого и поглощенного фотонов одинаковы (резонансная люминесценция); в спектрах испускания и поглощения (возбуждения) наблюдаются совпадающие узкие линии. Чаще, однако, в молекулах, особенно многоатомных, часть поглощенной энергии превращ. в тепловую (происходит диссипация энергии), что приводит к сдвигу спектра испускания относительно спектра возбуждения в низкочастотную (длинноволновую) область (закон Стокса). Спектры высвечивания и возбуждения люминесценции (имеется в виду наиб. низкочастотная полоса в спектре поглощения) зеркально симметричны относительно прямой, проходящей через точку их пересечения перпендикулярно оси частот, если по оси ординат откладывать интенсивность люминесценции P(), выраженную в числе фотонов на единичный интервал частот в единицу времени, или молярный — коэф. поглощения
а максимумы спектров нормировать к одной и той же величине. Это — т. наз. правило Лёвшина (правило зеркальной симметрии); оно соблюдается в том случае, когда при переходе в возбужденное состояние не происходит существ. изменения мол. структуры и частот колебаний, а меняются лишь равновесные длины связей. Величины P() связаны между собой универсальным соотношением Степанова:
где D — коэф. пропорциональности, не зависящий от , k и h — постоянные Больцмана и Планка соотв., Т — абс. т-ра. Если между актами поглощения и испускания фотона существенно меняется структура молекулы в возбужденном состоянии, зеркальная симметрия спектров поглощения и люминесценции нарушается, и для их описания используют четырехуровневую схему (рис. 2).
Рис. 2. Четырехуровневая схема квантовых переходов для молекулы, ядерная конфигурация к-рой в возбужденном состоянии существенно изменяется по сравнению с основным состоянием: 1 — основное состояние (синглетное); 1′ — основное состояние с ядерной конфигурацией, соответствующей конфигурации синглетного возбужденного состояния; 2 — возбужденное синглетное состояние с ядерной конфигурацией, соответствующей равновесной конфигурации основного состояния; 2′ — возбужденное синглетное состояние с равновесной ядерной конфигурацией (релаксированное).
Квантовый выход люминесценции L равен отношению числа испускаемых фотонов к числу поглощаемых. Он определяется квантовым выходом i образования данного возбужденного состояния, вероятностью испускания фотона или константой скорости kE этого процесса (определение см. ниже) и средним временем жизни i возбужденного состояния:
kЕ ~ 104
P = (3cos2 + 3). Для = 0 Р = 1/2, для = 90° Р = — 1/3.
Спектр поляризации,
т.е. зависимость степени поляризации или анизотропии от частоты (или длины волны) возбуждающего света, содержит информацию об относит. направленности моментов разл. электронных переходов молекулы. Вращение молекул в маловязких средах и процессы переноса энергии приводят к уменьшению степени поляризации (деполяризация люминесценции). Влияние вязкости среды
на степень поляризации люминесценции описывается ур-нием:
1/Р = 1/Р0 + (1/Р0 — 1/3)
0 — квантовый выход люминесценции в отсутствие тушителя, К -константа тушения. Различают статич. и динамич. тушение люминесценции. Первое обусловлено образованием в осн. электронном состоянии нелюминесцирующих мол. комплексов и не сопровождается изменением времени затухания люминесценции; при этом К примерно равно константе равновесия комплексообразования (при близких значениях коэф. поглощения комплекса и люминофора на длине волны возбуждения). Второе вызывается взаимод. возбужденных молекул с др. молекулами и сопровождается пропорциональным уменьшением времени затухания (); в этом случае К = kQ0, где kQ — константа скорости такого взаимод., 0 — время затухания люминесценции в отсутствие тушителя.
О применении люминесценции в технике и аналит. химии см. Люминофоры, Люминесцентный анализ.
===Исп. литература для статьи «ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ»: Паркер С., Фотолюминесценция растворов, пер. с англ., М., 1972; Лакович Дж. Р., Принципы флуоресцентной спектроскопии, пер. с англ., М., 1986; Modern fluorescence spectroscopy. ed. by E. L Wehry, v. 1-2, L, 1976.
М. Г. Кузьмин.
Страница «ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ» подготовлена по материалам химической энциклопедии.
Еще по теме:
ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ
2.1 Явление люминесценции
При поглощении фотона электрон переходит на одну из свободных орбиталей (т.е. на новый энергетический уровень) и молекула оказывается в возбужденном состоянии. Таких уровней может быть несколько, и молекула может оказаться на любом из них, в зависимости от того, какой была длина волны действующего излучения (см. рис. 2.1).
Люминесценция триптофана в замороженном растворе при 77 К
Рис.2.1. Электронные переходы в молекуле при поглощении света, флуоресценции и фосфоресценции.
Около возбужденных уровней (S, S, T)показано время жизни соответствующих состояний в секундах.
Обратный переход на основной уровень приводит к уменьшению энергии системы, которая может выделиться по частям, растратившись на колебательные движения ядер и поступательное движение молекул растворителя, т. е. теплоту, или же эта энергия возбужденного состояния может выделиться одной порцией в виде кванта люминесценции.
Важно отграничить явление люминесценции от других способов излучения света молекулами. По определению С. И. Вавилова, люминесценцией тела в данной
спектральной области называют избыток излучения над температурным
что это избыточное излучение обладает конечной длительностью, превышающей период световых колебаний.
Образование электронно-возбужденных молекул может быть не только результатом поглощения ими квантов света, но и следствием химических реакций, электрического разряда и др. Поэтому в зависимости от источника энергии при возбуждении молекул говорят о разных типах люминесценции.
Люминесценцию, возникшую в результате освещения молекул, называют . Свечение, сопровождающее химические реакции, называется (слабая хемилюминесценция сопровождает, например, свободнорадикальное цепное окисление органических соединений, включая липиды). Многие живые организмы, например светляки, бактерии, некоторые морские организмы, способны испускать довольно сильный свет в результате реакций, катализируемых специфическими ферментами; такое свечение называют . В физике известны явления , , ,
. Эти термины указывают на то, что причиной образования электронно-возбужденных молекул в этих случаях является нагревание образцов, пропускание электрического тока, воздействие ультразвуком, трение поверхностей.
Электронные переходы в возбужденной молекуле
исходном (невозбужденном) состоянии молекулы находятся на самом нижнем из возможных энергетических уровней (см. рис. 2.1), т.е. на нижнем колебательном подуровне основного состояния. У органических молекул, имеющих систему сопряженных двойных связей, это состояние , при котором спины электронов
на верхней заполненной орбитали (S) антипараллельны. Вероятность самопроизвольного перехода молекулы на более высокий энергетический уровень за счет тепловой энергии молекул зависит от разности в заселености уровней, которая определяется уравнением Больцмана
где и – уровней; –
число молекул в основном и возбужденном состояниях; ∆– разница энергий постоянная Больцмана; – абсолютная температура.
Например, в молекуле фенилаланина ∆для ближайших колебательных подуровней 0,1 эВ (при 300K 1эВ 38 ). Отсюда находим, что /= 2,2%.
Заселенность вышележащих электронных уровней еще ниже, так как ∆между уровнями больше. Таким образом, в состоянии теплового равновесия с окружающей средой
практически все молекулы находятся на самом нижнем колебательном подуровне самого нижнего электронного уровня.
Из основного состояния Sмолекула может перейти на разные колебательные подуровни вышележащих электронных энергетических уровней возбужденного состояния , и т. д., поглотив фотоны соответствующей энергии. Таким образом, длина стрелок вверх на рис. 2.1 отражает частоты и длины волн максимумов тонкой структуры спектров поглощения молекул по уравнениям:
Обычно приходится решать обратную задачу: зная структуру спектра поглощения, строить схему электронных уровней. Пример такого построения приведен на рис. 2.2. Поглощение фотона происходит за время порядка 10–10 с, в течение следующих 10–10 с устанавливается тепловое равновесие возбужденной молекулы с окружающей средой. В состоянии равновесия относительная заселенность подуровней в возбужденном состоянии, как и в основном, определяется уравнением Больцмана. Поэтому фактически за 10 с происходит растрата части энергии возбужденного состояния на тепловое движение окружающих молекул (диссипация части энергии фотона в теплоту). На схеме рис. 2.1 это выглядит как переход возбужденной молекулы с разных колебательных подуровней на нижний колебательный подуровень нижнего из возбужденных состояний
В люминесцирующих молекулах возбужденное (синглетное) состояние относительно устойчиво: электрон может находиться на соответствующем уровне 10–10 с.
Рис. 2.2. Построение схемы энергетических уровней и электронных переходов по спектрам поглощения и люминесценции.
: спектры поглощения и люминесценции в шкале энергий (или частот) фотонов, положения максимумов указаны в нанометрах; : энергетические электронные уровни.
Альтернативные пути растраты энергии возбуждения
отсутствие переноса энергии на другие молекулы и фотохимической реакции обратный переход возбужденной молекулы в основное состояние может происходить тремя путями.
Электрон переходит с уровня возбужденного состояния на уровень основного состояния , при этом высвечивается квант света . Так как такой переход может происходить на разные колебательные подуровни основного состояния, то в спектре флуоресценции возможна тонкая структура, которая размывается в полярных растворителях.
Энергия возбужденного состояния растрачивается на тепловые движения молекул. Квант света при электронном переходе с возбужденного уровня на основной не высвечивается (переход молекулы с уровня на уровень ). Такой электронный переход
называют . На рис. 2.2 безызлучательные переходы показаны пунктирными стрелками.
3. Происходит обращение спина электрона. Молекула переходит в состояние , энергия которого несколько ниже энергии синглетного состояния . Поскольку прямой переход из триплетного состояния в основное синглетное запрещен, т. е. маловероятен, молекула может находиться в триплетном состоянии сравнительно длительное время от 10 с до нескольких секунд. При обычных температурах в жидкой фазе за это время происходит тепловая диссипация энергии возбужденного триплетного состояния – безызлучательный переход в основное состояние.
2.3 Законы люминесценции
Схема на рис. 2.1 позволяет объяснить эмпирические законы люминесценции, которые и послужили основой для создания самой схемы. Это , , , . Кратко остановимся на существе этих законов.
2.3.1 Закон Стокса
(флуоресценции или фосфоресценции) называют зависимость
где – интенсивность света люминесценции в относительных единицах, измеренная при
длине волны . Согласно закону Стокса, спектр флуоресценции лежит в более длинноволновой области по сравнению со спектром поглощения того же соединения. Это означает, что средняя энергия квантов флуоресценции меньше средней энергии поглощенных квантов. На рис. 2.1 данная закономерность проявляется в том, что длина прямых стрелок вверх (электронные переходы при поглощении света) в среднем больше длины стрелок, направленных вниз (электронные переходы при флуоресценции и фосфоресценции). Причина такого явления уже была рассмотрена выше – это превращение части энергии поглощенного фотона в тепловую энергию окружающих молекул.
2.3.2 Правило Каши
Правило Каши относится к форме спектра флуоресценции при возбуждении объекта светом разных длин волн. Испускание квантов флуоресценции всегда происходит с нижнего возбужденного уровня молекулы, независимо от того, на какой уровень был заброшен перед этим электрон в результате поглощения фотона. Это означает, что какой бы длиной волны ни была возбуждена молекула (разные вертикальные стрелки вверх на
схеме), излучение будет происходит из одного и того же состояния молекулы, и спектр флуоресценции во всех случаях будет одинаковым. Следовательно,
(и фосфоресценции) не зависит от длины волны возбуждающего излучения.
Правило Каши и закон Стокса имеют большое значение при проведении спектрофлуориметрических измерений. В соответствии с законом Стокса, для возбуждения люминесценции используют излучение с длинами волн, меньшими коротковолновой границы спектра флуоресценции. Благодаря этому рассеянный объектом возбуждающий свет может быть полностью убран при помощи светофильтров или монохроматора и не мешает регистрации люминесценции.
Если в растворе люминесцирует одно вещество, то на форме спектра люминесценции длина волны возбуждения не сказывается (правило Каши). Это позволяет использовать спектрофлуориметрию для качественного и количественного анализа люминесцирующих веществ.
2.3.3 Правило Левшина
Правило Левшина, называемое также законом зеркальной симметрии, утверждает, что
спектры флуоресценции по форме зеркально симметричны длинноволновой полосе спектра поглощения, если они построены в шкале частот (энергий). Иллюстрацией этого правила могут служить спектры поглощения и флуоресценции антрацена, приведенные на рис. 2.3. Такое явление можно объяснить тем, что свойства молекулы, в частности расстояние между колебательными подуровнями и вероятности переходов на них, близки у молекул в основном и в состояниях. Это говорит о том, что геометрия молекул в состоянии мало изменяется по сравнению с основным состоянием. Более подробно вопрос рассмотрен в специальных руководствах.
Рис. 2.3. Правило зеркальной симметрии спектров поглощения и флуоресценции (правило Левшина).
: спектры; – электронные уровни и переходы.
2.3.4 Закон Вавилова
Закон Вавилова заключается в том, что квантовый выход флуоресценции не зависит от длины волны возбуждения люминесценции. Квантовым выходом люминесценции называют отношение числа квантов, высвеченных в виде люминесценции, к числу поглощенных образцом квантов. Очевидно, что эта величина может принимать значения от 0 до 1.
От чего зависит квантовый выход? Поглощение кванта света в области основного электронного перехода приводит к образованию молекулы в возбужденном состоянии (см. рис. 2.1) т. е. в состоянии S. Вероятность перехода молекулы из состояния Sв состояние Sпри поглощении фотона равна единице и не зависит от длины волны поглощенного фотона. Излучательный переход молекулы с нижнего подуровня возбужденного состояния происходит с вероятностью меньшей единицы, и сопровождается высвечиванием кванта флуоресценции. Очевидно, что и есть квантовый выход флуоресценции. Он меньше единицы, поскольку есть некоторая вероятность (1– ) безызлучательных переходов в основное состояние непосредственно или через триплетное состояние, а также других способов растраты энергии.
Сущность закона Вавилова состоит в том, что на каком бы уровне возбужденного состояния ни оказалась молекула при поглощении фотона (а это зависит от длины волны возбуждающего света), вопрос о том, быть ли переходу излучательным или нет, решается только после того как молекула растратила часть энергии возбуждения в тепло (разную в разных случаях) и оказалась на нижнем колебательном подуровне нижнего уровня возбужденного состояния (где она находится дольше всего).
2.4 Связь интенсивности люминесценции с концентрацией вещества. Люминесцентный анализ
люминесцентный анализ основан на сравнении формы спектров исследуемой смеси веществ с формой спектра индивидуальных соединений, которые могут входить в состав изучаемой смеси. По причинам, изложенным ниже, необходимо использовать растворы с низкой оптической плотностью (например, меньше 0,1), в противном случае требуется учитывать эффекты экранировки и реабсорбции. Как и в случае абсорбционной спектрофотометрии, для идентификации флуоресцирующего вещества наибольшее значение имеют положение максимума, наличие и характер тонкой структуры спектров, полуширина полос флуоресценции. Важная особенность флуоресценции смеси нескольких соединений состоит в том, что спектр смеси изменяется при изменении длины волны возбуждения, поскольку при разных длинах волн могут преимущественно возбуждаться разные соединения.
Перейдем к количественному определению флуоресцирующего вещества в растворе. Предположим, что на кювету с раствором флуоресцирующего вещества падает
монохроматический пучок света с мощностью Эйнштейн/с. Количество поглощенной световой энергии равно
, где – пропускание раствора. Из общего числа
поглощенных фотонов часть, равная квантовому выходу флуоресценции , высветится образцом в различных направлениях и во всей спектральной области люминесценции. Из этого общего светового потока с помощью светофильтров или монохроматора можно выделить и сфокусировать на приемник света световой поток, который будет
зарегистрирован в виде фототока :
Таким образом, интенсивностьлюминесценции пропорциональна интенсивности возбуждающего света , квантовому выходу люминесценции , коэффициенту поглощения света
. Коэффициент пропорциональности зависит от телесного угла,
в пределах которого собран свет люминесценции, ширины вырезаемой монохроматором или светофильтром спектральной области, пропускания монохроматора или светофильтра и чувствительности приемника света.
Рис. 2.4. К выводу уравнения количественного люминесцентного анализа. ( Объяснение в тексте)
Важно получить зависимость интенсивности измеряемой люминесценции от концентрации и свойств люминесцирующего вещества, для чего выразим светопоропускание через концентрацию и молярный коэффициент поглощения:
Разложим полученную степенную функцию в ряд; при малых значениях 0,05 можно
пренебречь высшими членами ряда и получить окончательное выражение для количественного люминесцентного анализа:
Итак, при низких оптических плотностях растворов интенсивность люминесценции пропорциональна концентрации флуоресцирующего вещества. На этом основан количественный флуоресцентный анализ. Необходимо иметь стандартный раствор
определяемого соединения с известной концентрацией ; измеряют интенсивность флуоресценции такого раствора и интенсивность флуоресценции исследуемого раствора . Концентрация вещества в исследуемом растворе легко определяется из соответствующей системы уравнений.
2.5 Спектры возбуждения люминесценции
Если возбуждение люминесценции осуществляется монохроматическим светом, выделяемым с помощью монохроматора, то появляется возможность измерить зависимость интенсивности люминесценции от длины волны возбуждающего света. Характер этой зависимости ясен из уравнения (2.4).
Поскольку квантовый выход флуоресценции для конкретного флуоресцирующего вещества, согласно закону Вавилова, от длины волны возбуждения не зависит (равно как и константа ясно, что форма спектра возбуждения повторяет форму зависимости от длины волны коэффициента поглощения, т. е. функции
()
Для образцов с низкой оптической плотностью уравнение переходит в уравнение . Так как и – постояные, то можно сказать, что спектр возбуждения флуоресценции в разбавленных растворах совпадает (по форме) со спектром поглощения флуоресцирующего соединения.
2.6 Приборы для регистрации люминесценции
2.6.1 Флуориметр со светофильтрами
Одно из достоинств метода регистрации люминесценции заключается в том, что для решения многих биологических задач не требуется использование сложных и дорогих приборов. Если не требуется проведения точных спектральных измерений или применения техники исследования быстро протекающих процессов, а требуется измерить интенсивность флуоресценции при возбуждении и регистрации в относительно широкой области спектра, то можно использовать простейший флуориметр со светофильтрами.
При измерении люминесценции существенным является выбор светофильтров, необходимых для разделения света, возбуждающего люминесценцию, и света люминесценции. Светофильтр для возбуждения люминесценции должен пропускать свет только в области поглощения исследуемого вещества и не должен пропускать свет в области, в которой образец люминесцирует. Светофильтр для люминесценции должен пропускать люминесценцию, но возбуждающий свет должен полностью им поглощаться.
Подбирая такую пару светофильтров, следует добиваться их хорошей : сложенные вместе эти два светофильтра совсем не должны пропускать свет (рис. 2.5).
Рис. 2.5. Использование скрещенных светофильтров для измерения люминесценции: кювета с образцом; и светофильтры; (1 + 2) спектр пропускания скрещенных фильтров. : схема прохождения света; : спектры пропускания светофильтров.
При перестановке скрещенных светофильтров фототок фотоэлемента или фотоумножителя, обусловленный люминесценцией, должен исчезать (закон Стокса!). В эксперименте иногда целосообразно произвести небольшие доработки заводского прибора, такого как флуориметр, которые позволяют резко расширить его возможности. Например, установив одну поляроидную пленку на пути возбуждающего света перед кюветой и используя две сменные поляроидные пленки после кюветы, можно измерять также величины . Можно изучать процесса, пользуясь проточными кюветами или добавляя растворы в кювету, снабженную мешалкой.
предназначены для регистрации спектров люминесценции или спектров возбуждения люминесценции. В идеале спектрофлуориметр состоит из двух монохроматоров; один – для выделения монохроматического возбуждающего света, другой – для измерения спектра люминесценции (рис. 2.6). Коммерческие приборы, как правило, снабжены кварцевыми кюветами толщиной 1 см, угол между направлениями возбуждения и люминесценции равен 90°.
Соседние файлы в папке физ1
