Для обнаружения и изучения бактерий применяют

Содержание

Методы определения вида микробов
Методы выявления капсул, жгутиков, спор
1 Методы обнаружения бактерий и определения их численности
Бактериоскопический метод исследования
Изучение микробов в живом состоянии

Методы определения вида микробов

Определение вида
микроорганизмов проводится с использованием
следующих методов исследования:

— бактериоскопический
метод
–
изучение микроорганизмов путем их
микроскопирования в живом или окрашенном
состоянии;

— бактериологический
метод
–
изучение характера роста микробов на
плотных и в жидких питательных средах,
определение ферментативной активности
микробов;

— серологический
метод
–
изучение антигенного строения микробов;

— биологический
метод
–
изучение патогенных свойств бактерий
с использованием лабораторных животных;

— аллергологический
метод –
метод
диагностики

инфекционных
заболеваний с помощью постановки кожных
проб;

— молекулярно-биологический
метод
–
изучение генетических особенностей
микробов.

Методы выявления капсул, жгутиков, спор

Для выявления
некоторых бактерий и отдельных структур
клеток применяют специальные методы
окраски.

Окраска
кислотоустойчивых бактерий по методу
Циля-Нильсена:

1. На фиксированный
мазок наносят карболовый раствор фуксина
через полоску фильтровальной бумаги и
подогревают до появления паров в течение
3-5 минут.

2. Снимают бумагу,
промывают мазок водой.

3. На мазок наносят
5% раствор серной кислоты или 3% раствор
солянокислого спирта на 1-2 минуты для
обесцвечивания.

4. Промывают водой.

5. Докрашивают
мазок водным раствором метиленового
синего в течение 3-5 минут.

6. Промывают водой,
высушивают и микроскопируют.

Выявление капсулы
по методу Гинса:

1. На предметное
стекло наносят каплю туши, а рядом –
каплю исследуемого материала. Обе капли
тщательно перемешивают и с помощью
шлифованного стекла готовят мазок.

2. Мазок высушивают
на воздухе и фиксируют на пламени
горелки.

3. Мазок окрашивают
фуксином в разведении 1:3 или сафранином.
При этом бактерии окрашиваются в красный
цвет, капсулы остаются неокрашенными
и выделяются на темном фоне препарата.

Окраска жгутиков
по Леффлеру:

1. Взвесь бактерий
переносят в каплю воды, не перемешивают
и высушивают.

2. Обрабатывают
препарат 15-20 минут протравой (1 мл
насыщенного спиртового раствора фуксина
+ смесь из 10 мл 25% водного раствора танина
с 5 мл насыщенного водного раствора
сернокислого железа).

3. Тщательно
промывают водой и высушивают на воздухе.

4. Докрашивают
фуксином Циля в течение 3-4 минут при
легком подогревании.

5. Промывают водой,
высушивают, микроскопируют.

Окраска спор по
методу Ожешки:

1. На нефиксированный
мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной
кислоты и подогревают на пламени горелки
в течение 2-3 минут.

2. Кислоту сливают,
препарат промывают водой, просушивают
и фиксируют над пламенем горелки.

3. Окрашивают
препарат по Цилю-Нильсену. Споры бактерий
при этом приобретают красный цвет, а
вегетативные формы – синий.

1 Методы обнаружения бактерий и определения их численности

Существует
большое количество классических и
инструментальных методов оценки
содержания и активности микроорганизмов,
однако почти все из них предназначены
для анализа клеток в жидких средах, и
только немногие методы позволяют
характеризовать численность и состояние
микроорганизмов на поверхности
материалов. В этих условиях одним из
традиционно используемых подходов для
оценки микробной загрязненности
объектов является взятие смывов
микроорганизмов с поверхностей с
последующим их анализом прямыми и
косвенными методами.

Прямые
способы анализа дают абсолютное значение
содержания микроорганизмов. Они, как
правило, не характеризуют активность
клеток. Среди прямых методов анализа в
лабораторной практике широко применяются
способы посева и культивирования
микроорганизмов на поверхности
агаризованных питательных сред. Данные
методы просты, высокочувствительны, не
требуют измерительного оборудования,
поэтому используются на производстве
и в арбитражных случаях. Основные
недостатки способов культивирования
связаны с высокой длительностью
трудоемкостью, большим расходом
питательных, сред и экономической
неэффективностью при большом количестве
микробиологических испытаний. Поэтому
наблюдается тенденция их замены на
инструментальные методы.

Рассмотрим
методы обнаружения бактерий и определения
их численности на примере бактерий,
вызывающих порчу пищевых продуктов.

В
традиционных методах исследования
пищевых продуктов на присутствие
специфической микробиоты порчи
используется методология культирования
на соответствующих средах. Образец
пищевого продукта размачивают или
гомогенизируют, используя гомогенизатор
или блендер, и приготавливают
соответствующие разбавления, которые
высевают на селективные или полуселективпые
среды для последующего выделения и
идентификации колоний. Численность
ассоциируемых с порчей молочнокислых
бактерий (МКБ) обычно оценивают путем
подсчета колоний.

Ряд
ограничений этой методологии не всегда
позволяет обнаружить микроорганизмы,
ответственные за изменение органолептических
свойств продукта, что может привести к
ошибочной идентификации или недооценке
бактерий порчи. Результаты зависят от
нескольких факторов: правильного выбора
культуральной среды, физиологического
состояния бактерий и применяемого
способа их иден-тификации.

Для
определения численности молочнокислых
бактерий (МКБ), присутствующих в
испорченном пищевом продукте, предложены
самые разные культуральные среды, в том
числе

MRS
и агар
Rogosa.
Для улучшения роста МКБ и предотвращения
роста дрожжей среду

MRS

можно
модифицировать путем добавления 0,1%
цистеингидрохлорида и 0,02% сорбата калия.
Кроме того, можно изменить значение рН
до 5,7; предпочтительнее использовать
анаэробное культивирование. Последняя
среда успешно используется для
анализа микробиоты МКБ порчи в копченых
сосисках в вакуумной упаковке. Другие
модификации MRS-агара
используются для идентификации
карнобактерий, участвующих в порче
мясного сырья, мяса птицы и морепродуктов
в вакуумной упаковке.

Для
селективного обнаружения карнобактерий
пригодны к использованию агар

CTAS

(крезоловый
красный – таллий – ацетат – сахароза)
и агар

EBRER.
Кроме того, в качестве селективной
среды для подсчета карнобактерий может
быть использован агар

CTSI

(крезоловый
красный – таллий – сахароза – инулин),
представляющий собой модификацию

CTAS —
агара.
Альтернативой
MRS —
агару
является агар NAP
(нитрит – ацетоин – полимиксин),
первоначально созданный для обнаружения
МКБ мяса. Он позволяет выявлять
лактобациллы, энтерококки и карнобактерии,
причем последние были идентифицированы
как доминирующие МКБ порчи и в том и в
другом продукте.

После
культивирования предполагаемых бактерий
порчи на соотвествующих культуральных
средах необходимо их идентифицировать.
В большинстве случаев колонии
отбираются из чашек Петри и после
пересева (субкультивирования) штаммов
применяют несколько процедур идентификации.
В качестве альтернативы для определения
принадлежности колоний к тому или иному
виду микроорганизмов можно использовать
методы гибридизации колоний. Существенную
роль для результата анализа играет
отбор изолятов из серии разбавлений
испорченного пищевого продукта,.
Если необходима характеризация
доминирующей популяции МКБ, то в целях
идентификации вида должны отбираться
только колонии из наивысших разбавлений.

Классическая
идентификация МКБ основывается на
морфологических, физиологических и
биохимических характеристиках. В
большинстве идентификационных ключей
используются такие характеристики, как
морфология клетки, рост при определенных
температурах, газообразование при
утилизации глюкозы и тип продуцируемого
изомера молочной кислоты, а также спектр
ассимилируемых или сбраживаемых
углеводов и источников азота. В настоящее
время доступны малогабаритные
тест-наборы для фенотипического
фингерпринтинга ,

в которых для получения фенотипического
«отпечатка» используются набор
дегидрированных реагентов и добавка
унифицированного инокулята. Данные,
получаемые с помощью этих автоматизированных
систем, должны тщательно интерпретироваться,
так как этим системам и присущи ряд
ограничений. Качество результатов
существенно зависит от надежности базы
данных. Как правило, эти фенотипические
методы характеризуются довольно низкой
воспроизводимостью и низким таксономическим
разрешением, что зачастую не позволяет
различать близкородственные микроорганизмы.

Более
надежный метод идентификация МКБ – это
полный анализ клеточных белков. Сравнение
состава клеточных белков, получаемого
с помощью унифицированного метода

SDS-PAGE
(натрийдодецилсульфат-полиакриломидный
гель- электрофорез), помогает
идентифицировать МКБ, вызывающих порчу
вин , сыров и МКБ, вызывающих порчу
морепродуктов.

Для
ускоренной идентификация МКБ порчи
может использоваться инфракрасная
спектроскопия на основе преобразования
Фурье

(FFIR) .

Для
обнаружения и идентификации бактерий
порчи применяются различные ДНК-методы,
разработанные, в основном, за последние
20 лет. Одним из их преимуществ является
независимость от изменения условий
роста микроорганизмов. Эти методы
идентификации включают секвенирование
последовательностей 165 или 235 рДНК,
ПЦР-анализы с применением родо- или
видоспецифических прай- меров, а также
методы ДНК-фингерпринтинга, основанные
на структурах ПЦР-амплифицированиых
фрагментов ДНК или на рестрикционных
анализах всей ДНК или ампликонов,
полученных с помощью селективной ПЦР
(полиморфизм длины фрагментов рестрикции,

RFLP ).

В
настоящее время не существует специфических
олигонуклеотидных праймеров для
обнаружения с помощью ПЦР-методов
отдельных видов

Pseudomonas

(например,

P
.

fluorescens
,

P
.

lundensis

и

P
.
fragi
) .

Тем не менее для различения видов

Pseudomonas
,

выделяемых из различных окружающих
сред, ПЦР-методы и

RFLP-анализ

(RFLP
–
полиморфизм
длины фрагментов рестрикции) могут
использоваться совместно. Для обнаружения
и определения количества псевдомонад
в мясе и молоке также может использоваться
ПЦР в сочетании с методом

ELISA
(иммуносорбентный анализ с ферментной
меткой).

Одним
из ускоренных методов идентификации
бактерий является риботипирование с
гибридизацией зондов специфических
генов рРНК и геномных ДНК-дайджестов с
последующим компьютерным анализом
сохраненных профилей генов рРНК для
каждого вида

Pseudomonas
.
Риботипирование может выполняться
вручную или с помощью автоматизированной
системы. Этот метод успешно используется
для описания признаков псевдомонад,
выделенных из сырого молока.

Популярным
средством идентификации

P
.

fragi
,

S
.

putrefaciens

и
Р.
fluorescens

становится прямое секвенирование
сегмента последовательности 16S
РНК. Применение автоматизированного
тест-набора для секвенирования
последовательности 16S
рРНК ускорило и облегчило идентификацию
видов

Pseudomonas

и

Sh

ewanella
.

Рост
и активность бактерий порчи можно также
оценить, анализируя изменения импеданса
в культуральной среде или в пищевых
продуктах под влиянием метаболизма
бактерий. К сожалению, попытки отслеживания
изменений численности псевдомонад
в сыром молоке методами импедиметрии
оказались успешными лишь частично.

Использование
специфических праймеров для ПЦР-реакции
с бактериальной ДНК, экстрагированной
из образца – это самый быстрый независящий
от культу- ральной среды метод родо-,
видо- или штаммоспецифического обнаружения
в пищевой матрице. Он позволяет обнаружить
определенные микроорганизмы

порчи,
присутствующие в пищевом продукте во
время технологического процесса,
без

применения
продолжительных процедур культивирования .

1.3.1.4
Методы,
применяемые без предварительного
культивирования

Еще
один не зависящий от культуральной
среды подход включает применение методов
гибридизации

in

situ
,

в которых искусственно созданные
олигонуклео- тиды присоединяются к
специфическим последовательностям –
мишеням (обычно 165 рДНК) бактериальной
ДНК. Наиболее часто применяется
флуоресцентная гибридизация

in

situ

(FISH ),

особенно для обнаружения бактерий в
напитках, в том числе в вине. Этот метод
позволяет за несколько часов произвести
прямую идентификацию и количественный
микроскопический анализ МКБ без
предварительного культивирования.
Бактериальные клетки образца, проницаемые
для флуоресцентно меченного олигонуклеотида,
фиксируют и иммобилизуют на предметных
стеклах или мембранных фильтрах,
гибридизируют

in

situ

с зондом, а затем подсчитывают под
эпифлуоресцентным микроскопом.
Гибридизацияю

in

situ

можно также сочетать с проточной
цитометрией.

Эпифлуоресцентная
микроскопия

(DEFT),
включающая захват бактериальных клеток
на поверхности мембранных фильтров и
окрашивание флуорохромом, нашла
применение в молочной и винной
промышленности.

Денатурирующий
градиентный гель-электрофорез
(DGGE )

и температурно- временной градиентный
гель-электрофорез

(TGGE)
могут применяться как не зависящие
от культуральной среды методы обнаружения
и анализа МКБ, вызывающих порчу
пищевых продуктов. В этих методах
изменяющийся участок гена 165 рРНК
амплифицируется посредством ПЦР, и
фрагменты ДНК одинакового размера
разделяются на полиакриламидном геле
в соответствии с их денатурирующим
профилем. Полученные полосы можно
оцифровывать и нормализовать, используя
эталонные структуры, с последующей
идентификацией расположения полос
путем их сравнения со структурами из
базы данных эталонных штаммов. Данный
подход использовался для идентификации
лактобацилл, участвующих в брожении
дрожжевого теста, и для изучения
микробиоты сыров. Метод

PCR
– DGGE ,

включающий идентификацию полос с помощью
секвенирования, применяется для анализа
порчи мясных продуктов под действием
МКБ на мясоперерабатывающем заводе.

1.3.1.5
Тесты на ассимиляцию углеводов,
жирнокислотные профили и моноклональные
антитела

Классическими,
стандартными процедурами идентификации
псевдомонад являются физиологическая
характеризация и тесты на ассимиляцию
углеводов. Необходимые тесты могут
выполняться вручную или с помощью
автоматизированных тест-наборов.

Вид
псевдомонад, вызывающих порчу пищевых
продуктов, можно определить также с
помощью анализа жирнокислотного состава
бактериальных клеток.

В
качестве белка-мишени для обнаружения
псевдомонад могут использоваться белки
внешней мембраны

Pseudomonas
.

Для различения флуоресцентных и
нефлуоресцентных псевдомонад
используют липопротеин I и ген, кодирующий
этот белок. Белок

OprF

внешней
мембраны и антитело к этому белку
используют для обнаружения псевдомонад
из группы I подобия рРНК. Поликлональные
антитела по отношению к белку внешней
мембраны ( F
)

и живым клеткам

P
.

fluorescens

используют
для обнаружения псевдомонад в охлажденном
мясе. В настоящее время разработаны
также моноклональные антитела для
специфического белка внешней мембраны
Pseudomonas
,

которые используются для обнаружения
псевдомонад в охлажденном мясе
непрямым методом

ELISA
.

1.3.1.6
Методы обнаружения, идентификации и
количественного определения спорообразующих
бактерий

1.3.1.6.1
Аэробные и факультативные анаэробные
спорообразующие бактерии

Представителей
рода

Bacillus

и близкородственных им родов выделяют
по их характеристикам роста или типу
порчи. В методах количественного
определения микроорганизмов,
вызывающих порчу сильнокислых, кислых,
подкисленных и слабокислых пищевых
продуктов, используют значения рН и
температурный диапазон роста, а также
тип порчи (например, плоскокислая) под
действием конкретных групп
микроорганизмов. Общим тестом для
представителей рода

Bacillus

является
тест на «аэробные мезофильные
спорообразующие бактерии», причем В.

cereus

–единственный вид, для которого имеется
специфическая селективная среда. Подсчет
аэробных спор может производиться
разными методами, но обычно используют
триптоновый агар с декстрозой или
глюкозой.

Для
психротрофных микроорганизмов разработан
модифицированный метод Миколайчика с
применением теплового шока при 75 °С
в течение 20 мин, хранения образцов при
7,2 ° С в течение 8–10 суток и последующим
посевом на стандартный агар .

Метод, который обычно используют для
выделения мезофильных аэробных
спорообразующих бактерий, включает
посев на чашки с глюкозо-триптоновым
агаром после нагревания до 80 °С в
течение 30 мин с последующим аэробным
культивированием при 35 °С.

После
этого для идентификации изолятов можно
использовать различные методы,
включая молекулярные и более традиционные,
основанные на биохимических или
фенотипических свойствах. К сожалению,
традиционные методы характеризуются
довольно ограниченной способностью
различения видов и зачастую не согласуются
с результатами идентификации, полученными
с использованием таких относительно
новых методов, как полимеразная цепная
реакция (ПЦР,

PCR
)

и
ДНК-ДНК-гибридизация. Кроме того,
отсутствуют селективные культуральные
среды, позволяющие обнаруживать виды
микроорганизмов, относящиеся к данной
группе. Тем не менее классические методы
все еще остаются полезными, особенно в
тех случаях, когда оказываются
недостаточными или неудовлетворительными
такие методы, как секвенирование
последовательности 165рРНК/ДНК.
Альтернативным подходом, применяемым
для различения видов

Bacillus
,

для их идентификации и таксономии,
является профилирование белков методом

MALDI-TOF-масс —
спектрометрии

(Matrix-Assisted
Laser
Desorption/Ionisation
Time-Of-Flight ,

матричная лазерная десорбционная
ионизационая времяпролетная
масс-спектрометрия). Для
В.
pumilus

этот метод хорошо коррелирует с
секвенированнем gyrB

и
ДНК-ДНК гибридизацией. Идентификация
аэробных спорообразующих бактерий
всегда была трудной задачей, и хотя в
настоящее время появился ряд тонких
методов, не всегда пригодных для
повседневного применения, фенотипическая
характеризация по-прежнему остается
важным инструментом идентификации.

Способы
идентификации

Alicyclobacillus

spp
.

отличаются по различающей способности
и сложности; в некоторых из них используются
ПЦР-методы, гомология ДНК-ДНК и
сравнительный анализ рибосомных
последовательностей или анализ
случайно амплифицированной полиморфной
ДНК а в других – более практичные методы,
например метод прямого эпифлуоресцентного
фильтра ,

образование в чашках постороннего
запаха или стандартные биохимические
и морфологические тесты.

Для
идентификации
В.
coagulans
,
а также других видов этого рода и
близкородственных родов обычно
применяют биохимические тест-наборы
совместно с микроскопией, гидролизом
казеина и характеристиками роста
(температура и анаэробный рост). Для их
диффенциации используют и другие методы,
в том числе анализ состава жирных кислот,
состава оснований ДНК, секвенирование
гена последовательности 165 рРН,
подходы, основанные на

RAPD

или их комбинации. Для ряда аэробных
спорообразующих бактерий порчи, включая

P
.

macerans
,
разработаны ПЦР-методы обнаружения,
использующие праймеры, мишенями которых
являются видоспецифические
последовательности гена 165рРНК.

1.3.1.6.2
Анаэробные спорообразующие бактерии

Подсчет
анаэробных бактерий может производиться
с использованием десятичных разбавлений
и

RCM
—
агара
или методом наиболее вероятного
количества ( MPN
)
с

использованием пробирок со средой

DRCM
.

Идентификацию
клостридий обычно проводят путем оценки
фенотипических свойств изолятов, включая
разжижение желатина, продуцирование
индола, проверки подвижности, положения
спор, востановления нитрата и сбраживания
углеводов. Для анализа конечных
продуктов брожения может применяться
газожидкостная хроматография. В
качестве альтернативы могут также
использоваться профили биохимических
реакций, имеющимися в тест-наборах .

Для идентификации и харакгеризации
анаэробных микроорганизмов,

Bacillus

и других близкородственных аэробных
спорообразующих бактерий разработаны
новые методы, в том числе с использованием
антител, например

ELISA

(Enzyme-Linked
Immunosorbent
Assay,
твердофазный иммуноферментный анализ)
и ДНК-методы. Разработанные ДНК-зонды
и ПЦР-методы, основанные на специфических
последовательностях 165 рРНК, успешно
применяются для идентификации различных
клостридиальных видов, в частности С.

tyrobutyricum
.

Бактериоскопический метод исследования

Клетки микроорганизмов
можно изучать как в живом состоянии
(метод раздавленной капли и метод висячей
капли), так и в фиксированном и окрашенном
состоянии.

Метод раздавленной
капли
. На
поверхность обезжиренного предметного
стекла наносят каплю исследуемого
материала или суспензию бактерий и
покрывают ее покровным стеклом. Капля
не должна выходить за края покровного
стекла. Микроскопируют препарат с
объективом х40. Метод раздавленной капли
удобен для исследования подвижности
бактериальных клеток, а также для
изучения крупных микроорганизмов —
плесневых грибов, дрожжей.

Метод висячей
капли
.
Препарат готовят на покровном стекле,
в центр которого наносят каплю
бактериальной суспензии. Затем специальное
предметное стекло с лункой, края которой
предварительно смазаны вазелином,
прижимают к покровному стеклу так, чтобы
капля находилась в центре лунки. Препарат
переворачивают покровным стеклом вверх.
В правильно приготовленном препарате
капля должна свободно висеть над лункой,
не касаясь ее дна или краев. Для микроскопии
используют вначале сухой объектив х8,
под увеличением которого находят края
капли, а затем устанавливают объектив
х40 и исследуют препарат.

Приготовление
фиксированных препаратов
.
Для приготовления препарата на
обезжиренное предметное стекло наносят
каплю воды или изотонического раствора
хлорида натрия, в которую бактериологической
петлей вносят исследуемый материал и
круговыми движениями петли распределяют
его таким образом, чтобы получить тонкий
и равномерный мазок диаметром 1-1,5 см.
Если исследуют жидкий материал, то его
наносят на предметное стекло непосредственно
петлей и готовят мазок. Мазки высушивают
на воздухе.

Для фиксации

используют физические и химические
методы. Для фиксации мазка физическим
методом предметное стекло медленно
проводят 3 раза через пламя горелки.
Мазки крови, мазки-отпечатки органов и
тканей фиксируют химическим методом
путем погружения их на 5-20 минут в
метиловый или этиловый спирт, смесь
Никифорова и другие фиксирующие жидкости.

Для окрашивания

микробов используют простые и сложные
методы. При простом методе фиксированный
мазок окрашивают каким-либо одним
красителем, например, водным раствором
фуксина (1-2 минуты) или метиленовым синим
(3-5 минут), промывают водой, высушивают
и микроскопируют. Сложные методы
окрашивания включают последовательное
использование нескольких красителей.
Это позволяет выявить определенные
структуры клеток и дифференцировать
одни виды микроорганизмов от других.

Соседние файлы в папке Лекции

Изучение микробов в живом состоянии

Клетки микроорганизмов
в живом состоянии изучают методом
раздавленной капли и методом висячей
капли.

Метод раздавленной
капли
. На
поверхность обезжиренного предметного
стекла наносят каплю исследуемого
материала или суспензию бактерий и
покрывают ее покровным стеклом. Капля
должна быть небольшой, не выходящей за
края покровного стекла. Микроскопируют
препарат с объективом х40. Метод
раздавленной капли удобен для исследования
подвижности бактериальных клеток, а
также для изучения крупных
микроорганизмов — плесневых грибов,
дрожжей.

Метод висячей
капли
.
Препарат готовят на покровном стекле,
в центр которого наносят каплю
бактериальной суспензии. Затем предметное
стекло с лункой, края которого
предварительно смазывают вазелином,
прижимают к покровному стеклу так, чтобы
капля находилась в центре лунки. Препарат
переворачивают покровным стеклом вверх.
В правильно приготовленном препарате
капля должна свободно висеть над лункой,
не касаясь ее дна или края. Для микроскопии
используют вначале малый сухой объектив
х8, под увеличением которого находят
края капли, а затем устанавливают
объектив х40 и исследуют препарат.