Метафазная пластинка с филадельфийской хромосомой. Хромосомы окрашены в синий цвет, локус ABL1 — красный цвет, локус BCR — зелёный цвет. Вверху слева — хромосома с перестройкой, отмечена красно-зеленой точкой
Флуоресце́нтная гибридиза́ция in situ, или метод FISH (англ. fluorescence in situ hybridization — FISH), — цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ. Кроме того, FISH используют для выявления специфических мРНК в образце ткани. В последнем случае метод FISH позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в клетках и тканях.
Цитогенетические аномалии — это генетические дефекты, затрагивающие большие участки хромосом, а не маленькие фрагменты ДНК (например, транслокации, большие делеции или анеуплоидии). Эти дефекты могут быть обнаружены по меньшей мере тремя методами – хромосомным (кариотипическим) анализом, флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH) с использованием специфических ДНК-зондов либо на метафазных хромосомах, либо на межфазных ядрах и сравнительной геномной гибридизацией массива (aCGH). Последние два метода считаются “молекулярной цитогенетикой”, поскольку они могут обнаруживать аномалии, которые ниже разрешения хромосомного анализа.
Для записи на программу свяжитесь с нами по телефону или заполните форму ниже — мы свяжемся с Вами в течение одного рабочего дня.
Цитогенетический анализ для оценки HER2-статуса пациента с использованием методов in situ hybridization (ISH) – FISH или его аналогов (CISH, SISH). Позволяет выявить наличие или отсутствие специфических ДНК-последовательностей в хромосомах. FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) применяется для выявления амплификации гена HER2 с использованием ДНК-зондов, меченных флуорохромами с использованием флуоресцентного микроскопа. CISH (хромогенная гибридизация in situ) – альтернативный нефлуоресцентный метод, при котором выявление гибридизованных ДНК-зондов происходит с помощью иммунопероксидазной реакции. Позволяет выявлять амплификацию гена HER2 с учетом морфологической картины ткани под обычным световым микроскопом. SISH является разновидностью метода CISH; полностью автоматизированный метод, при котором для выявления гена HER2 используется серебряная метка, гибридизация в ткани осуществляется с осаждением серебром (silverenchanced in situ hybridization, SISH).
Гибридизация in situ.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Образец ткани в парафиновом блоке; образец ткани на стекле (готовый микропрепарат).
Для чего используется исследование?
Что означают результаты?
Результат оценивается как соотношение числа копий гена HER2 к числу копий 17-й хромосомы.
Согласно обновленным рекомендациям 2018 г. Американского общества клинической онкологии и Коллегии американских патологов (ASCO/CAP), оценка результатов ISH-исследования проводится в комбинации с данными ИГХ и базируется на основании подсчета количества копий гена HER2/neu и соотношения HER2/CEP17 в 20/40 ядрах опухолевых клеток. Амплификация считается подтвержденной при значениях HER2/CEP17 ≥ 2 и числе копий гена HER2/neu ≥ 4.
Стандарты HER2 тестирования и четкий алгоритм его проведения и интерпретации результатов изложены в рекомендациях ASCO/CAP.
Онколог, педиатр, акушер-гинеколог, врач-генетик.
Флуоресцентная гибридизация () – цитогенетический метод исследования, в процессе которого детектируется наличие и локализация специфических ДНК-последовательностей на хромосомах. Ген ТР53 является «стражем генома», в его функции входит контроль за целостностью ДНК. Если геном клетки повреждается, ТР53 запускает процессы апоптоза (саморазрушения клетки), в том числе и в кроветворной ткани. Мутации в этом гене приводят к тому, что клетка не разрушается, а продолжает функционирование с нарушенным генотипом. Исследование на наличие мутаций в гене ТР53 крайне важно для диагностики и прогнозирования течения множественной миеломы и хронического лимфолейкоза.
Флуоресцентная гибридизация in situ, молекулярная диагностика онкогематологических заболеваний – хронический лимфолейкоз и множественная миелома.
Fluorescent in situ hybridization, molecular diagnostics of oncohematological diseases: chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma.
Флуоресцентная гибридизация in situ.
Как правильно подготовиться к исследованию?
Специальной подготовки не требуется.
Общая информация об исследовании
Анализ с помощью флюоресцентной in situ гибридизации (fluorescence in situ hybridization, FISH) – молекулярно‐цитогенетический метод для идентификации генетических аберраций (отклонений от нормы). Изначально он использовался как исследовательский для выявления наличия или отсутствия специфической ДНК-последовательности в хромосомах, но благодаря прогностической ценности был внедрен в клиническую практику.
Метод основан на использовании флуоресцентномеченых ДНК-зондов, которые представляют собой искусственно синтезированные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды), последовательность которых комплементарна последовательности ДНК исследуемых аберрантных хромосом. Д НК-зонды различаются по специфичности: для каждой хромосомной аномалии используются свои ДНК-зонды. Также зонды различаются по размеру: одни могут быть направлены к целой хромосоме, другие – к конкретному локусу (фрагменту хромосомы или гена).
После специальной процедуры – денатурации молекула ДНК приобретает вид одноцепочечной нити. Д НК-зонд гибридизуется (связывается) с комплементарной ему нуклеотидной последовательностью и может быть обнаружен при помощи флуоресцентного микроскопа. Данное состояние интерпретируется как положительный результат FISH-теста. При отсутствии аберрантных хромосом несвязанные ДНК-зонды в ходе реакции «отмываются», что при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа определяется как отсутствие флуоресцентного сигнала (отрицательный результат FISH-теста). Метод позволяет определить не только наличие флуоресцентного сигнала, но и его интенсивность и локализацию. Таким образом, FISH-тест – это еще и количественный метод.
FISH имеет широкие возможности в клинической онкологии для обнаружения хромосомных аномалий в опухолевых клетках. Метод позволяет исследовать генетический состав клетки как во время митоза, так и в интерфазе. Он имеет высокую чувствительность – позволяет обнаружить индивидуальные гены, кроме того, в одном препарате может быть использовано несколько зондов с различными красителями.
FISH-анализ широко применяется при лимфопролиферативных заболеваниях, являясь в ряде случаев определяющим фактором для подтверждения диагноза.
Хронический лимфолейкоз характеризуется моноклональной экспансией зрелых В-клеток и крайне гетерогенным клиническим течением, отражающим сложность геномных изменений. Мутационный статус гена-супрессора опухоли TP53 важный пример этой сложности, поскольку он может изменяться в течение заболевания. Примечательно, что мутационный статус TP53 является как прогностическим, так и фармакопредиктивным фактором, который необходимо оценить до первого лечения и который требуется учитывать в последующем для контроля терапевтического эффекта и оценки вероятности механизмов резистентности. Поскольку изменения в гене TP53 связаны с большинством пациентов, устойчивых к химио- и иммунотерапии, приводя к более короткой выживаемости даже в эпоху новых лекарств, точный анализ мутаций TP53 и делеции соответствующего хромосомного локуса 17p13.1 (del (17p) должны учитываться при первичной диагностике еще до начала лечения. Клиническое течение хронического лимфолейкоза очень неоднородно: от стабильного в течение десятилетий до довольно быстрого прогрессирования, требующего лечения. Пациенты с генетическими аномалиями, включая цитогенетические аберрации и генные мутации (в том числе делеции гена TP53), как правило, имеют плохой прогноз.
Множественная миелома (ММ) представляет собой В‐клеточное новообразование, характеризующееся большой геномной и молекулярной сложностью, что в значительной степени объясняет вариабельность, наблюдаемую во время клинического течения и ответа на лечение. Цитогенетические аномалии остаются наиболее значимыми прогностическими факторами. Делеция хромосомы 17p (del (17p), которая содержит локус гена TP53, присутствует у 8–13 % впервые диагностированных пациентов с ММ и, вероятно, является цитогенетическим изменением, связанным с наиболее неблагоприятным прогнозом, ухудшая выживаемость. Биаллельная инактивация (инактивация обоих аллельных вариантов) гена TP53 встречается менее чем в 1 % случаев и ассоциируется с крайне неблагоприятным прогнозом.
Когда назначается исследование?
Кто назначает исследование?
Спектральное кариотипирование
Спектральное кариотипирование (SKY, также называемое многоцветным FISH) — это метод FISH, точно определяющий хромосомное происхождение всех элементов в кариограмме (полный набор хромосом) с использованием нескольких длин волн света для генерации сигналов многих цветов. Комбинацию из пяти флуорохромов можно использовать в качестве зондов, чтобы «окрасить» все 22 аутосомы, а также X- и Y-хромосомы в разные цвета. Кариограмма анализируется с помощью компьютеризированного спектрального устройства формирования изображений, и хромосомы классифицируются на основе их конкретных спектров излучения.
Преимущества этой техники:
Хромосомный анализ
Хромосомный анализ (также называемый бэндингом хромосом) используется для обнаружения изменений в больших участках хромосом (транслокаций, крупных делеций или анеуплоидий).
Для проведения хромосомного анализа лимфоциты, обычно полученные из периферической крови, культивируют in vitro и стимулируют к делению под действием митогенов. Также могут быть проанализированы, часто без митогенного стимула, другие типы клеток: амниоциты, клетки костного мозга, фибробласты и опухолевые клетки. Как только клетки легко делятся, добавляется химическое вещество для остановки митотического деления в метафазе. В этой фазе клеточного цикла хромосомы максимально сжаты, и, следовательно, их полосы легче распознать.
Для идентификации каждой отдельной хромосомы используется хромосомное бэндирование, необходимое для оценки того, присутствует ли правильное количество каждой хромосомы (две из каждой аутосомы плюс половые хромосомы) и имеются ли структурные аномалии. Эта техника может быть выполнена с использованием различных ферментов и красителей. Наиболее часто используемый метод полос — GTG (G-полоса с трипсином и полоса Гимзы). Идентичный образец полос наблюдается при Q-полосовании, при котором хромосомы окрашиваются флуоресцентным красителем и просматриваются в ультрафиолетовом свете.
Типичное разрешение бэндинга хромосом составляет около 400 полос в гаплоидном наборе из 23 хромосом. Одна полоса хромосом может содержать 6 мегабаз (Mb) ДНК и примерно 150 генов. Если требуется более высокое разрешение полос для изучения относительно небольших хромосомных перестроек, клеточные циклы могут быть синхронизированы, и клетки могут быть остановлены в прометафазе (550 полос) или даже профазе (приблизительно 800 полос). Последний метод называется полосованием с высоким разрешением.
Примеры использования этого метода включают оценку пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ).
Преимущества хромосомного бэндинга:
Недостаток: большинство методов кольцевания хромосом позволяют обнаружить только основные структурные аномалии и не обнаруживают увеличения или потери меньших участков ДНК.
Что делать при отклонениях
В
случае обнаружения генных мутаций или
хромосомных аберраций у одного из
супругов на этапе планирования
беременности, врач-генетик объясняет
паре вероятность рождения больного
ребенка и возможные риски.
Как
известно, хромосомная и генная патология
неизлечима, поэтому дальнейшее решение
ложится на плечи будущих родителей
(воспользоваться донорской спермой или
яйцеклеткой, рискнуть родить ребенка
или остаться без детей).
При
обнаружении хромосомных аномалий во
время беременности, особенно у эмбриона,
женщине предлагают ее прервать. Настаивать
на прерывании беременности врачи не
имеют права.
При
некоторых хромосомных аномалиях
(например, риск рождения ребенка с
патологией не высокий) генетик может
назначить курс определенных витаминов,
которые снижают вероятность рождения
больного ребенка.
Флуоресцентная гибридизация in situ (fish)
FISH
сочетает в себе преимущества классических
цитологических, цитогенетических и
новейших молекулярных методов. Подобно
классическим методам в гистологии,
цитологии и цитогенетике, FISH может
проводиться на тканевых, клеточных и
хромосомных препаратах. Однако объектом
исследования в данном случае являются
не морфологические особенности ткани,
клеток или хромосом, а уникальные
нуклеотидные последовательности
конкретной хромосомы или ее отдельного
участка. Соответственно, выявляемые
изменения являются генетическими
(этиопатогенетическими), а не
морфологическими (фенотипическими), и
относятся к более тонкому уровню
организации наследственного материала
клетки.
Подобно
цитологическим и классическим
цитогенетическим методам, FISH метод
позволяет оценить генетический статус
отдельной клетки и выявить, к примеру,
несколько этиопатогенетически значимых
аномальных клеток среди тысяч других
с нормальным генотипом. Такое не под
силу ни одному методу, даже такому
распространенному молекулярному методу
как ПЦР, при котором ДНК всех клеток
смешивается и результат усредняется.
В
описываемом методе используются короткие
последовательности ДНК, называемые
зондами, которые являются комплементарными
по отношению к последовательностям
ДНК, представляющим объект изучения.
Зонды гибридизуются (связываются) с
комплементарными участками ДНК и
благодаря тому, что они помечены
флуоресцентной меткой, позволяют видеть
локализацию интересующих генов в составе
ДНК или хромосом. В отличие от других
методов изучения хромосом, требующих
активного деления клетки, FISH можно
выполнять на неделящихся клетках,
благодаря чему достигается гибкость
метода.
Рис.1
Гибридизация
in situ с флуоресцентной меткой (FISH)
FISH
может применяться для различных целей
с использованием зондов трех различных
типов:
Материалом
для исследования является кровь, костный
мозг, биопсия опухоли, плацента,
эмбриональные ткани или амниотическая
жидкость.
Образцы для исследования должны
доставляться в лабораторию в свежем
виде. Препараты (слайды) готовятся
непосредственно из образцов ткани или
после их культивирования. Могут
использоваться как метафазные, так и
интерфазные препараты клеток. Меченные
флуоресцентными метками специфические
ДНК-зонды гибридизуюся с хромосомной
ДНК, причем можно одновременно использовать
множественные зонды к разным локусам.
FISH
является полезным и чувствительным
методом цитогенетического анализа при
выявлении количественных и качественных
хромосомных аберраций, таких как делеции
(в том числе и микроделеции), транслокации,
удвоение и анэуплоидия. F ISH
на интерфазных хромосомах служит быстрым
методом пренатальной диагностики
трисомий по 21, 18 или 13 хромосомам или
аберраций половых хромосом.
Рис.2
Детекция
хромосомной перестройки методом
флуоресцентной in situ гибридизации
хромосомных пэйнтинг проб с метафазными
хромосомами пациента.
Зеленый сигнал
— материал хромосомы 5, красный сигнал
— матерал хромосомы 20. Общее окрашивание
хромосом красителем DAPI (синий сигнал).
Однако,
флуоресцентная гибридизация in situ имеет
один существенный недостаток. Зонды
являются специфичными только к одному
участку генома и, как следствие, при
одном исследовании можно определить
наличие или число копий только этого
участка (или нескольких при использовании
многоцветных зондов). Поэтому
важным является правильная клиническая
предпосылка, а FISH анализ может только
подтвердить или не подтвердить диагноз.
В последнем случае анализ приходится
повторять в отношении сходных синдромов
и это далеко не всегда приносит желаемый
результат. Альтернативой этому методу
является хромосомный микроматричный
анализ, который при такой же точности,
чувствительности и специфичности
определяет количество генетического
материала в сотнях тысяч (и даже миллионах)
точек генома, что дает возможность
диагностики пактически всех известных
микроделеционных и микродупликационных
сииндромов.
Соседние файлы в предмете Генетика
Кариотипирование при помощи многоцветного FISH
Флуоресцентная гибридизация in situ на хромосомах курицы. Стрелки указывают на меченные локусы гомологичных макрохромосом; видны также многочисленные мелкие пятнышки — микрохромосомы
Мечение зонда может осуществляться разными способами, например, путём ник-трансляции или при помощи ПЦР с мечеными нуклеотидами.
Аббревиатура
FISH расшифровывается как fluorescent in situ
hybridization – флуоресцентная гибридизация
на месте. Это цитогенетический метод,
который применяют для выявления и
определения положения специфической
последовательности ДНК на хромосомах.
Для этого используют специальные зонды
— нуклеозиды, соединенные с флуорофорами
или некоторыми другими метками.
Визуализацию связавшихся ДНК-зондов
проводят при помощи флуоресцентного
микроскопа.
Метод
FISH позволяет изучать небольшие хромосомные
перестройки, которые не идентифицируются
при стандартном исследовании кариотипа.
Однако, имеет один существенный
недостаток. Зонды являются специфичными
только к одному участку генома и, как
следствие, при одном исследовании можно
определить наличие или число копий
только этого участка (или нескольких
при использовании многоцветных зондов).
Поэтому важным является правильная
клиническая предпосылка, а FISH анализ
может только подтвердить иди не
подтвердить диагноз.
Альтернативой
этому методу является хромосомный
микроматричный анализ, который при
такой же точности, чувствительности и
специфичности определяет количество
генетического материала в сотнях тысяч
(и даже миллионах) точек генома, что дает
возможность диагностики практически
всех известных микроделеционных и
микродупликационных сииндромов.
RGEN-ISL Метод молекулярной визуализации с помощью РНК-направляемой эндонуклеазы CRISPR/dCas9 связанной с меткой. В отличие от классической флуоресцентной гибридизации in situ, RGEN-ISL не требует денатурации ДНК и, следовательно, обеспечивает лучшую сохранность структуры хроматина.
Интерфазная FISH (флуоресцентная гибридизация in situ)
Интерфазная флуоресцентная гибридизация in situ используется, когда делящиеся клетки недоступны (например, в полностью дифференцированных клетках или в тканях, которые были зафиксированы и залиты парафином). Это также улучшает разрешение зондов FISH.
Для интерфазной FISH клетки тестируют с помощью FISH-зондов без синхронизации клеточного цикла. При использовании интактных ядер (например, не из ткани, залитой парафином) клетки собирают с помощью гипотонического раствора, фиксируют и снова «капают» на предметные стекла. Для FISH на тканях, залитых в парафин, делают тонкие срезы патологических образцов и прикрепляют к предметным стеклам.
Поскольку хромосомы лишь минимально конденсируются в интерфазе, эта модификация анализа FISH предоставляет возможность гибридизировать зонды с высоким разрешением (значительно меньше 1 Мб, по сравнению с 2 Мб для метафазного анализа FISH).
В интерфазном ядре невозможно различить хромосомные структуры и будет светиться только гибридизированный зонд. Гибридизация с двумя разными цветовыми зондами, пересекающими области точек разрыва генов, участвующих в транслокации, приводит к ожидаемым сигналам от нормальной хромосомы, а также к сигналу слияния от производной хромосомы (хромосом), на которой гены сопоставляются в результате транслокации.
Преимущества интерфазной FISH включают более высокое разрешение, чем метафазная FISH. Имеется возможность проведения теста сразу, без культивирования клеток, что делает его более быстрым. Интерфазная FISH имеет особое значение в пренатальной диагностике различных состояний анеуплоидии, таких как трисомия 18 или трисомия 21, при которых возможность быстрого получения результатов помогает в принятии решения.
Основным недостатком интерфазы по сравнению с метафазной FISH считается то, что при интерфазной FISH невозможно визуализировать сами хромосомы. Таким образом, невозможно предоставить информацию об общем количестве и составе хромосом.
Сравнительная геномная гибридизация
Сравнительная геномная гибридизация (CGH) позволяет обнаруживать амплификации и делеции небольших участков ДНК по длине всех хромосом. Этот метод работает путем сравнения геномного содержимого (или ДНК) пациента (или мишени) с нормальным контрольным индивидуумом (или индивидуумами). Разрешение «классического» или метафазного CGH относительно низкое (примерно 15 Мб ДНК).
Массив CGH представляет собой модификацию сравнительной геномной гибридизации, в которой ДНК, РНК или ткань сравнения располагаются на предметном стекле или стеклянных шариках. Существует три основных типа массивов: массивы бактериальных искусственных хромосом (ВАС), массивы олигонуклеотидов (обычно длиной 60 пар оснований) или массивы однонуклеотидного полиморфизма (SNP) (обычно несколько нуклеотидов). Большинство массивов на основе SNP также включают зонды с одним локусом, а также SNP.
Существует как минимум два разных типа массивов: «целевые» массивы и массивы целых геномов.
Массивы как SNP, так и олигонуклеотидов могут обнаруживать вариации числа копий, но только массивы SNP можно использовать для определения отсутствия или потери гетерозиготности (AOH или LOH) для различных областей или даже целых хромосом при наличии нормального числа копий. A OH относится к наследованию только отцовских или материнских аллелей. Отсутствие наследования от двух родителей можно увидеть при одноплодной дисомии (UPD) или в некоторых образцах раковой ткани.
Одноплодная дисомия может быть результатом гетеродисомии, при которой присутствуют две разные гомологичные хромосомы от одного и того же родителя (либо по материнской, либо по отцовской линии) вместо нормального вклада двух родителей (по одной хромосоме от каждого родителя). Альтернативно, одноплодная дисомия может возникать при наличии двух идентичных копий одной родительской хромосомы (изодисомия). S NP-массивы могут обнаруживать только UPD, вторичные по отношению к изодисомиям.
Интерпретация массива CGH также может быть осложнена присутствием вариантов числа копий (CNVs), которые могут быть доброкачественными, патогенными или неизвестными.
Преимущества массива CGH:
Недостатками этой техники считаются:
Продолжение статьи
Кариотип
– систематизированный набор хромосом
ядра клетки с его количественными и
качественными характеристиками.
Нормальный
женский кариотип — 46,XX
Нормальный мужской кариотип — 46,XY
Исследование
кариотипа — процедура, призванная выявить
отклонения структуры строения и числа
хромосом.
К
сожалению, с помощью исследования
кариотипа можно определить лишь крупные
структурные перестройки. В большинстве
же случаев аномалии строения хромосом
представляют собой микроделеции и
микродупликации невидимые под микроскопом.
Однако такие изменения хорошо
идентифицируются современными
молекулярными цитогенетическими
методами — флуоресцентной гибридизацией
(FISH) и хромосомным микроматричным
анализом.
Что выявляет кариотипирование
Интерпретацию
анализа на кариотипирование проводит
врач-генетик. Анализ в норме выглядит
как 46ХХ или 46ХУ. Но если выявлена
какая-либо генетическая патология,
например выявление третьей лишней 21
хромосомы у женщины, то результат будет
выглядеть как 46,ХХ +21.
Что
позволяет определить анализ хромосомного
набора:
Например,
обнаружение делеции в У-хромосоме часто
является причиной нарушенного
сперматогенеза и, следовательно, мужского
бесплодия. Также известно, что делеции
являются причиной некоторых врожденных
патологий у плода.
Для
удобства отображения на бумаге результата
анализа при обнаружении изменения
структуры хромосомы, длинное
плечо записывается латинской буквой
q, а короткое t.
Например, при потере фрагмента короткого
плеча 5-ой хромосомы у женщины, результат
анализа будет выглядеть так: 46, ХХ 5t, что
означает синдром «кошачьего крика»
(генетическое отклонение, характеризующееся
характерным плачем ребенка и другими
врожденными нарушениями).
Кроме
того, кариотипирование позволяет оценить
состояние генов. Путем данного метода
исследования можно выявить:
Кроме
того, кариотипирование помогает
диагностировать генетическую
предрасположенность ко многим
заболеваниям, например, к инфаркту
миокарда, сахарному диабету,
гипертонической болезни, патологии
суставов и пр.
Хромосомный микроматричный анализ
Хромосомный
микроматричный анализ –
молекулярно-цитогенетический метод
для выявления вариаций числа копий ДНК
по сравнению с контрольным образцом.
При выполнении этого анализа исследу¬ются
все клинически значимые участки генома,
что позволяет с максимальной точностью
исключить хромосомную патологию у
обследуемого. Таким образом могут быть
выявлены патогенные деле¬ции (исчезновение
участков хромосом), дупликации (появление
дополни¬тельных копий генетического
материала), участки с потерей
гетерозиготности, которые имеют важное
значение при болезнях импринтинга,
близкородственных браках,
аутосомно-рецессивных заболеваниях.
Когда
необходим хромосомный микроматричный
анализ
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) — это метод, позволяющий подсчитывать количество и расположение крупных фрагментов хромосом. Этот метод значительно повысил чувствительность, специфичность и разрешение хромосомных анализов. F ISH можно проводить на метафазных хромосомах или интерфазных ядрах; интерфазную FISH можно проводить на ткани, залитой в парафин.
Метафазная флуоресцентная гибридизация in situ позволяет идентифицировать крупные хромосомные аномалии, включая делеции, дупликации и транслокации, а также более мелкие хромосомные микроделеции и дупликации. Для метафазной FISH клетки останавливаются в митозе, как и для хромосомного связывания. Затем их фиксируют смесью уксусной кислоты и метанола, а затем «капают» на предметное стекло микроскопа, где они прикрепляются. Используются ДНК-зонды длиной в несколько сотен килобаз (кб), которые соответствуют участкам хромосом, содержащим рассматриваемую последовательность ДНК. Эти зонды непосредственно гибридизуются с хромосомами на предметном стекле (отсюда и термин «гибридизация in situ»). Немедленное обнаружение флуоресцентного сигнала возможно с помощью флуоресцентной микроскопии. Также доступны менее широко используемые методы изотопной и неизотопной химической маркировки.
Зонды FISH производят флуоресцентную точку на хромосоме, с которой они гибридизуются. Таким образом, каждая пара хромосом (или хромосомных участков) дает две точки. Эти двойные точки иногда сливаются, образуя один сигнал. Клетки, являющиеся моносомными для рассматриваемой хромосомной области, будут показывать только одну точку на ядро, в то время как трисомные клетки будут показывать три точки.
Флуоресцентную гибридизацию in situ также можно модифицировать для анализа интерфазных ядер.
Преимущества этого метода:
Схема эксперимента по флуоресцентной гибридизации in situ для локализации положения гена в ядре
На первом этапе происходит конструирование зондов. Размер зонда должен быть достаточно большим для того, чтобы гибридизация происходила по специфическому сайту, но и не слишком большой (не более 1 тыс. п. о.), чтобы не препятствовать процессу гибридизации. При выявлении специфических локусов или при окраске целых хромосом надо заблокировать гибридизацию ДНК-проб с неуникальными повторяющимися ДНК-последовательностями путём добавления в гибридизационную смесь немеченой ДНК повторов (например, Cot-1 DNA). Если ДНК-зонд представляет собой двуцепочечную ДНК, то перед гибридизацией её необходимо денатурировать.
На следующем этапе приготавливают препараты интерфазных ядер или метафазных хромосом. Клетки фиксируют на субстрате, как правило, на предметном стекле, затем проводят денатурацию ДНК. Для сохранения морфологии хромосом или ядер денатурацию проводят в присутствии формамида, что позволяет снизить температуру денатурации до 70 °C.
Далее к препарату добавляют зонды и осуществляют гибридизацию около 12 часов. Затем проводят несколько стадий отмывок для удаления всех негибридизовавшихся зондов.
Визуализацию связавшихся ДНК-зондов проводят при помощи флуоресцентного микроскопа. Интенсивность флуоресцентного сигнала зависит от многих факторов — эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флуоресцентного красителя.
