ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ ЧТО ЭТО ТАКОЕ

Деление раковой клетки. Изображение получено с использованием сканирующего флуоресцентного микроскопа. Специальные методы ввода флуоресцентных маркеров и использование нескольких светофильтров позволяют наблюдать одновременно за несколькими объектами.

Текущая версия страницы пока не проверялась опытными участниками и может значительно отличаться от версии, проверенной 14 сентября 2022 года; проверки требуют 3 правки.

Флуоресценция уранового стекла в ультрафиолетовом свете

Тоник при облучении видимым (слева) и ультрафиолетовым (справа) светом. Голубая флуоресценция обусловлена наличием в напитке производных хинина

Физические основы флуоресценции

Флуоресценция — это одно из явлений, которые могут происходить во время взаимодействия электромагнитного излучения с веществом.

Поглощение света и флуоресценция

Флуоресценцию можно наблюдать невооружённым глазом. На снимке раствор перилена в дихлорметане во время облучения длинноволновым ультрафиолетом

Сильно упрощённая схема спектрофлуориметра, прибора, с помощью которого изучают флуоресценцию

Флюоресценция в ультрафиолетовом свете 0,0001 % водных растворов: голубым — хинина, зелёным — флуоресцеина, оранжевым — родамина-B, жёлтым — родамина-6G

К флуоресценции способны многие органические вещества, как правило содержащие систему сопряжённых π-связей. Наиболее известными являются хинин, метиловый зелёный, метиловый синий, феноловый красный, кристаллический фиолетовый, бриллиантовый синий кризоловый, POPOP, флуоресцеин, эозин, акридиновые красители (акридиновый оранжевый, акридиновый жёлтый), родамины (родамин 6G, родамин B), нильский красный и многие другие.

Флуоресцентные зонды и метки

Наиболее распространёнными флуоресцентными метками в клеточной и молекулярной биологии являются флуоресцентные белки. Мечение зелёным флуоресцентным белком и его аналогами является рутинной процедурой, используемой при изучении структуры и функций белков в различных модельных организмах.

Возможный ответ флуоресцентного зонда на связывание с аналитом

Флуоресцентный зонд может по-разному изменять флуоресценцию при связывании с аналитом, что схематично показано на рисунке: флуоресценция может расти (случай А), угасать (В) или полностью изменить один из параметров, например, цвет (случай С).

Преимущества флуоресцентных методов исследования

Изображение отдельных молекул жёлтого флуоресцентного белка (YFP), полученное с помощью флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения

Существует большое количество флюорофоров, каждый из которых характеризуется определённым максимумом эмиссии (цветом флуоресценции). Это открывает возможность для мультиплексной детекции, то есть для наблюдения за несколькими объектами одновременно, если они закодированы флюорофорами с разными цветами эмиссии. Спектры эмиссии флюорофоров должны при этом не перекрываться. Если использовать флюорофоры с узкими спектрами, такие как квантовые точки, возможно наблюдать даже за пятью внутриклеточными целями одновременно.

Трансгенные мыши, экспрессирующие ген усиленного зелёного флуоресцентного белка (eGFP)

Совместимость с живыми организмами

За последние годы были разработаны многочисленные биосовместимые флюорофоры и флуоресцентные зонды. Среди них особенно выделяются флуоресцентные белки. Благодаря генной инженерии флуоресцентные белковые маркеры разных цветов могут быть присоединены к протеинам у различных лабораторных организмов (англ. ). На фотографии справа изображены мыши, в геном которых был встроен ген eGFP — усиленного зелёного флуоресцентного белка.

Высокая скорость ответа

Пространственное разрешение метода указывает, на каком минимальном расстоянии должны находиться объекты для того, чтобы их можно было однозначно различить. Пространственное разрешение очень важно в исследованиях живых систем на микроскопическом уровне. Линейный размер отдельных клеточных структур, таких как, например, ядерные поры, может составлять десятки нанометров, что делает их недосягаемыми для классической оптической микроскопии.

Благодаря некоторым особенностям процесса флуоресценции, таким как, например, возможности управляемо избавляться от нежелательной эмиссии на определённых участках образца с помощью дополнительного облучения (англ. stimulated emission depletion,) в конце XX века были разработаны методы оптической микроскопии сверхвысокого разрешения (англ. super resolution microscopy).

Характеристики флуоресцентной эмиссии

Существует ряд количественных параметров, описывающих флуоресцентное излучение.

Общий вид флуоресцентного микроскопа «Олимпус» Бэ-Икс 61

Методы флуоресцентной окраски клеток

Некоторые низкомолекулярные органические красители проявляют аффинность к определённым биомолекулам или целым клеточным органеллам. Это явление используется для селективной мультицветной окраски клеток во флуоресцентной микроскопии. Отдельные примеры красителей приведены в таблице.

Окраска клеток с использованием органического красителя (синий цвет — окраска ядра DAPI) и иммунофлуоресцентной окраски (зелёный цвет — антитела к микротрубочкам, меченые флуоресцеином)

Существенным недостатком использования малых органических соединений в качестве флуоресцентных красителей является низкая селективность мечения клеточных компонентов. Например, соединения, которые связываются с хромосомной ДНК, могут в той или иной степени окрашивать другие нуклеиновые кислоты, содержащиеся в клетке; липофильные красители, окрашивающие липидные мембраны, могут также связываться с гидрофобными сайтами белков.

Селективного флуоресцентного мечения внутриклеточных структур можно достичь с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания клеток. Этот метод сочетает селективность традиционных методов иммуноокраски с чувствительностью флуоресцентной детекции.

Как и классическая иммуноокраска, этот метод базируется на использовании антител. Антитела — это белковые молекулы, которые с высокой афинностю и селективностью связываются со своими мишенями. Каждое антитело распознаёт свой определённый антиген.

Использование двух антител, первичного и вторичного, необходимо для обеспечения гибкости метода, то есть ради возможности варьировать окраски различных мишеней без необходимости получения и химической модификации новых антител.

Недостатком иммунофлуоресцентной покраски является низкая проницаемость антител сквозь клеточные мембраны. Вследствие этого данный метод чаще всего используется для окраски фиксированных клеток.

Генетически запрограммированные автофлуоресцентные белки, созданные на базе зелёного флуоресцентного белка (ЗФБ) и его аналогов, являются незаменимыми флуоресцентными маркерами клеточной и молекулярной биологии.

Упрощённая схема сканирующего конфокального эпифлуоресцентного микроскопа. Зелёные линии показывают путь возбуждающего света. Красные линии показывают путь флуоресцентного света

Кроме растровых конфокальных микроскопов существуют другие типы этих приборов.

Флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения

Слева направо: 1) двумерная проекция возбуждающего лазерного импульса; 2) двумерная проекция STED импульса; 3) Зона возбуждения после наложения STED и возбуждающего импульсов

Сравнение разрешающей способности обычной конфокальной (левый верхний угол) и STED-микроскопии (правый нижний угол)

В растровом флуоресцентном конфокальном микроскопе изображение создаётся последовательным перемещением луча лазера от точки к точке кадра, регистрацией флуоресценции и последующей реконструкцией изображения на компьютере. Как оказалось, этот метод имеет некоторые недостатки. Явление дифракции накладывает определённые физические ограничения на минимальный размер сфокусированного лазерного луча, а следовательно, и на максимальное пространственное разрешение метода.

Одним из первых способов стала STED-микроскопия (микроскопия на основе подавления спонтанного испускания). В основе этого метода лежит взаимодействие флюорофоров, возбуждённых обычным лазерным импульсом, с последующим STED-импульсом. Если возбуждённые молекулы флюорофора облучить электромагнитным импульсом, который по энергии соответствует ожидаемой энергии флуоресценции, происходит принудительное подавление эмиссии. Флюорофоры, которые попали под STED-импульс, не могут флуоресцировать. Если варьировать фазы возбуждающего и STED-импульсов, можно получить различную их локализацию в пространстве. Так, рисунок справа показывает проекцию начального лазерного импульса, форму STED-импульса, и участок, содержащий возбуждённые флюорофоры после наложения двух импульсов.

Благодаря этому была уменьшена площадь, с которой регистрируется флуоресценция, а следовательно, повышено пространственное разрешение метода. На фотографии слева показаны для сравнения два изображения одного и того же объекта, сделанные с использованием растровой конфокальной и STED-микроскопии.

Смежные явления, важные для биологических применений

В исследованиях биологических систем полезными являются некоторые явления, связанные с флуоресценцией.

В производстве красок и окраске текстиля

Флюоресцирующие элементы одежды в свете фотовспышки с яркими оттенками

Флуоресцентные пигменты добавляются в краски, фломастеры, а также при окраске текстильных изделий, предметов обихода, украшений и т. п. для получения особо ярких («кричащих», «кислотных») цветов с повышенным спектральным альбедо в нужном диапазоне длин волн, иногда превышающим 100 %. Данный эффект достигается за счёт того, что флуоресцентные пигменты преобразуют содержащийся в естественном свете и в свете многих искусственных источников ультрафиолет (а также для жёлтых и красных пигментов, коротковолновую часть видимого спектра) в излучение нужного диапазона, делая цвет более интенсивным. Особой разновидностью флуоресцентных текстильных пигментов является оптическая синька, преобразующая ультрафиолет в излучение синего цвета, компенсирующее естественный желтоватый оттенок ткани, чем достигается эффект белоснежного цвета одежды и постельного белья. Оптическая синька применяется как при фабричной окраске тканей, так и для освежения цвета при стирке, в стиральных порошках. Аналогичные пигменты применяются и в производстве многих сортов бумаги, включая бумагу для повседневного офисного использования. В ней содержание пигмента с синькой, как правило, наибольшее.

Флуоресцентные краски, в сочетании с «чёрным светом», часто используются в дизайне дискотек и ночных клубов. Практикуется также применение флуоресцентных пигментов в красках для татуировки.

В биологии и медицине

Флюоресценция (снизу) под ультрафиолетовым освещением спиртового раствора хлорофилла

В биохимии и молекулярной биологии нашли применение флуоресцентные зонды и красители, которые используются для визуализации отдельных компонентов биологических систем. Например, эозинофилы (клетки крови) называются так потому, что имеют сродство к эозину, благодаря чему легко поддаются подсчёту при анализе крови.

Флуорофоры с высокими квантовыми выходами и хорошей фотостойкостью могут применяться в качестве компонентов активных сред лазеров на красителях.

Один из элементов защиты банкноты в 50 евро — флюоресцирующая краска некоторых элементов рисунка и флуоресцирующие полимерные нити в бумаге. Вид при ультрафиолетовом освещении

Отдельные флуоресцирующие вещества используются в оперативно-разыскной деятельности (для нанесения пометок на деньги, иные предметы в ходе документирования фактов дачи взяток и вымогательства. Также могут использоваться в химловушках.

В гидрологии и экологии

• Векшин Н. Л. Флуоресцентная спектроскопия биополимеров. Фотон-век, 2007.
• Vekshin N. L. Photonics of biopolymers. Springer, 2002.
• Vekshin N. L. Energy transfer in macromolecules. S PIE, 1997

Впервые флуоресценцию соединений хинина наблюдал физик Джордж Стокс в 1852 году.

Примеры использования флуоресценции

В оригинальном методе Сэнгера использовалось энзиматическое удлинение праймера, меченного радиоактивным изотопом (32Р на 5’гидроксильной группе) в четырёх разных пробирках. К каждой из них добавлялся небольшой процент одного определённого дидезокситерминатора. Из-за этого синтез в каждой пробирке обрывался в определённый момент, но всегда на позиции того нуклеотида, который был в форме дидезокситерминатора. Кроме использования радиоактивных изотопов, другим недостатком этого метода было большое количество операций, необходимое для обнаружения и считывания радиоактивного сигнала, а также необходимость использования четырёх дорожек для каждого анализа, потому что невозможно было различить разные терминированные фрагменты только по их радиоактивности.

Флуоресцентные дидезокситерминаторы для автоматического секвенирования по Сенгеру

Метод секвенирования с дидезокситерминаторами был существенно усовершенствован, когда радиоактивное мечение праймера было заменено на флуоресцентное мечение терминальных нуклеотидов. На рисунке показана структура дидезоксинуклеозид-трифосфатов, которые содержат флуоресцентные красители, привязанные ковалентными связями к азотистым основаниям. Было обнаружено, что такие модификации азотистых оснований минимально влияют на распознавание трифосфатов ДНК-полимеразами, поэтому они могут встраиваться в синтезированную ДНК наряду с обычными дНТФ. В случае с флуоресцентными дидезокситерминаторами при терминации синтеза ДНК происходит её флуоресцентное мечение. Использование флуоресцентных красителей четырёх цветов для кодирования каждого из природных нуклеозидов позволило проводить синтез в одной пробирке и разделение на одной дорожке геля. Более того, флуоресцентная детекция оказалась более чувствительной и быстрой по сравнению с радиоактивной, позволяя проводить определение нуклеотидов в реальном времени.

В результате в конце 1980-х удалось разработать автоматические системы для секвенирования ДНК с разделением терминированных фрагментов в капиллярном варианте гель-электрофореза и с детекцией каждой «буквы» в последовательности по её специфическому цвету флуоресценции.

флуоресцентная гибридизация in situ между метафазными хромосомами и двумя ДНК-зондами, мечеными красным и зелёным цветами. Колокализация целевых фрагментов наблюдается в местах, которые флуоресцируют жёлтым

Молекулы ДНК состоят из двух цепей полинуклеотидов, которые комплементарны друг другу. Азотистые основания двух цепей образуют пары, которые стабилизированы водородными связями. Характерной чертой нуклеиновых кислот является способность к молекулярному узнаванию, благодаря которой одноцепные фрагменты ДНК имеют сродство с комплементарными фрагментами.

На основе явления гибридизации были созданы методы анализа последовательностей нуклеиновых кислот с использованием синтетических флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов.

Часто стоит задача определить, содержится ли последовательность ДНК нужной структуры в растворе, например в клеточном экстракте или в смеси продуктов полимеразной цепной реакции. Флюоресцентная гибридизация in situ для этого непригодна, потому что при связывании меченой ДНК с мишенью не произойдет изменения флуоресценции, а отделить связанный и несвязанный зонд, как в случае с хромосомами, невозможно из-за их одинаковой растворимости и других физико-химических свойств.

«Молекулярный маяк». Переход закрытой нефлуоресцентной формы (слева) в открытую флуоресцентную (справа) происходит в присутствии ДНК-мишени. F = флюорофор; Q = гасители флуоресценции

Эта технология оказалась удобной для анализа уровня экспрессии генов в клетках. Для этого нужен ДНК-микромассив, содержащий набор олигонуклеотидных маркеров, специфических для каждого из генов, которые нужно исследовать. Для того, чтобы сравнить уровень экспрессии в двух образцах, контрольном и исследуемом, проводят следующие операции.

Значение слова «флюоресценция»

Делаем Карту слов лучше вместе

Привет! Меня зовут Лампобот, я компьютерная программа, которая помогает делать
Карту слов. Я отлично
умею считать, но пока плохо понимаю, как устроен ваш мир. Помоги мне разобраться!

Спасибо! Я стал чуточку лучше понимать мир эмоций.

Вопрос: оледенить — это что-то нейтральное, положительное или отрицательное?

Синонимы к слову «флюоресценция»

Вопрос: выклейка — это что-то нейтральное, положительное или отрицательное?

Синонимы к слову «флуоресценция»

Структурные формулы представителей основных классов флуоресцентных красителей: кумаринов

, борфторидных комплексов дипирролилметена (BODIPY), 2), цианиновых красителей

, флуоресцеинов

, родаминов

и скваринов

Флуоресцентные спектры красителей различного химического строения

Другой особенностью малых органических флюорофоров является то, что их флуоресценцию можно «включать» с помощью минимальных изменений в химической структуре. Это широко используется в создании флуоресцентных зондов на основе таких молекул. Примером является флуоресцеин, который может существовать в форме двух таутомеров: в нефлуоресцентной лактонной форме и флуоресцентной открытой форме.

Преобразование лактонной формы флуоресцеина

в открытую

Медуза Aequorea victoria, из которой впервые был выделен зелёный флуоресцентный белок, родоначальник большого семейства флуоресцентных белков

Трёхмерная структура молекулы зелёного флуоресцентного белка и структурная формула его флюорофора

Чашка Петри с бактериями, экспрессирующими 8 различных флуоресцентных белков.

Флуоресцентные наночастицы и нанокластеры

Суспензии флуоресцентных квантовых точек различных размеров. Диаметр частиц увеличивается слева направо.

В простейшем случае для наблюдения флюоресценции нужны только раствор флуоресцентного соединения и соответствующий источник света для возбуждения. Удобным источником возбуждения являются ручные ультрафиолетовые лампы.

Значение слова «флуоресцентный»

Вопрос: отчётливо различимый — это что-то нейтральное, положительное или отрицательное?

Синонимы к слову «флуоресцентный»

Согласно представлениям квантовой химии, электроны в атомах расположены на энергетических уровнях. Расстояние между энергетическими уровнями в молекуле зависит от её строения. При облучении вещества светом возможен переход электронов между различными энергетическими уровнями. Разница энергии между энергетическими уровнями и частота колебаний поглощённого света соотносятся между собой уравнением (II постулат Бора):

Соотношение спектров поглощения и флуоресценции

Схематически процессы поглощения света и флуоресценции показывают на диаграмме Яблонского.

При нормальных условиях большинство молекул находятся в основном электронном состоянии . При поглощении света молекула переходит в возбуждённое состояние . При возбуждении на высшие электронные и колебательные уровни избыток энергии быстро расходуется, переводя флуорофор на самый нижний колебательный подуровень состояния . Однако, существуют и исключения: например, флуоресценция азулена может происходить как из , так и из состояния.

Квантовый выход флуоресценции

Квантовый выход флуоресценции показывает, с какой эффективностью проходит данный процесс. Он определяется как отношение количества испускаемых и поглощаемых фотонов. Квантовый выход флуоресценции может быть рассчитан по формуле

Тогда доля флуорофоров, возвращающихся в основное состояние с испусканием фотона, и, следовательно, квантовый выход:

Из последней формулы следует, что если , то есть если скорость безызлучательного перехода значительно меньше скорости излучательного перехода. Отметим, что квантовый выход всегда меньше единицы из-за стоксовых потерь.

Термин «флуоресценция» происходит от названия минерала флюорит, у которого она впервые была обнаружена, и лат.  — суффикс, означающий слабое действие.