К МИНИМАЛЬНОМУ РАЗМЕРУ ОБЪЕКТА В МИКРОСКОПЕ ОТНОСИТСЯ И ОПТИКА ГЛАЗ

Микроскопическое исследование в биохимической лаборатории

Микроскопия (МКС) (греч.  — мелкий, маленький и σκοπέω — вижу) — изучение объектов с использованием микроскопа. Подразделяется на несколько видов: оптическая микроскопия, электронная микроскопия, многофотонная микроскопия, рентгеновская микроскопия, рентгеновская лазерная микроскопия и предназначается для наблюдения и регистрации увеличенных изображений образца.

Текущая версия страницы пока не проверялась опытными участниками и может значительно отличаться от версии, проверенной 19 июня 2015 года; проверки требуют 14 правок.

Дифракцио́нный преде́л — это минимальное значение размера пятна (пятно рассеяния), которое можно получить, фокусируя электромагнитное излучение. Меньший размер пятна не позволяет получить явление дифракции электромагнитных волн.

Дифракционный предел был открыт в 1873 году Эрнстом Аббе.

Методы уменьшения дифракционного предела

Микроскоп (от греч. mikros — малый и skopeo — смотрю) — оптический прибор для получения увеличенного изображения мелких объектов и их деталей, невидимых невооруженным глазом.

Первый из известных микроскопов был создан в 1590 году в Нидерландах потомственными оптиками Захарием и Хансом Янсенами, смонтировавшими две выпуклые линзы внутри одной трубки. Позднее Декарт в своей книге «Диоптрика» (1637) описал более сложный микроскоп, составленный из двух линз — плоско-вогнутой (окуляр) и двояковыпуклой (объектив). Дальнейшее же совершенствование оптики позволило Антони ван Левенгуку в 1674 г. изготовить линзы с увеличением, достаточным для проведения простых научных наблюдений и впервые в 1683 году описать микроорганизмы.

Современный микроскоп (рисунок 1) состоит из трех основных частей: оптической, осветительной и механической.

1 — основание микроскопа; 2 — коробка с механизмом микрометрического фокусирования; 3 — микрометрический винт; 4 — макрометрический винт; 5 и 6 — винты для перемещения столика; 7 — тубусодержатель; 8 — головка микроскопа; 9 — насадка монокулярная (тубус с окуляром); 10 — винт для крепления насадки; 11 — винт, фиксирующий револьвер относительно тубуса; 12 — револьвер с объективами; 13 — предметный столик; 14 — винт для крепления конденсора; 15 — конденсор; 16 — дополнительная линза; 17 — рукоятка кронштейна; 18 — зеркало; 19 — кронштейн. Рисунок 1 — Схема микроскопа «Биолам»

Основными деталями оптической части микроскопа являются две системы увеличительных линз: обращенный к глазу исследователя окуляр и обращенный к препарату объектив. Окуляры имеют две линзы, верхняя из которых называется главной, а нижняя собирательной. На оправе окуляров обозначают производимое ими увеличение (×5, ×7, ×10, ×15). Количество окуляров у микроскопа может быть различным, в связи с чем различат монокулярные и бинокулярные микроскопы (предназначены для наблюдения за объектом одним или двумя глазами), а также тринокуляры, позволяющие подключать к микроскопу системы документирования (фото- и видеокамеры).

Объективы представляют собой систему линз, заключенных в металлическую оправу, из которых передняя (фронтальная) линза производит увеличение, а лежащие за ней коррекционные линзы устраняют недостатки оптического изображения. На оправе объективов цифрами также указано производимое ими увеличение (×8, ×10, ×40, ×100). Большинство моделей, предназначенных для микробиологических исследований, имеют в комплекте несколько объективов с разными степенями увеличения и поворотный механизм, предназначенный для их быстрой смены – турель, часто называемый «револьверной головкой».

Осветительная часть предназначена для создания светового потока, который позволяет осветить объект таким образом, чтобы оптическая часть микроскопа предельно точно выполняла свои функции. Осветительная часть в прямых микроскопа проходящего света расположена за объектом под объективом и включает в себя источник света (лампу и электрический блок питания) и оптико-механическую систему (конденсор, полевую и апертурную регулируемую диафрагмы). Конденсор состоит из системы линз, которые предназначены для собирания идущих от источника света лучей в одной точке – фокусе, которая должна находиться в плоскости рассматриваемого объекта. В свою очередь д иафрагма расположена под конденсором и предназначена для регулирования (увеличения или уменьшения) потока лучей, проходящих от источника света.

Механическая часть микроскопа содержит детали, объединяющие описанные выше оптическую и осветительную части, а также позволяющие размещать и перемещать исследуемый препарат. Соответственно, механическая часть состоит из основания микроскопа и держателя, к верхней части которого прикрепляются тубус – полая трубка, предназначенная для размещения объектива, а также упомянутая выше револьверная головка. Ниже находится предметный столик, на который устанавливаются предметные стекла с исследуемыми образцами. Предметный столик может перемещаться в горизонтальной плоскости с использованием соответствующего устройства, а также вверх и вниз, что обеспечивает настройку резкости изображения с помощью грубого (макрометрического) и точного (микрометрического) винтов.

Увеличение, которое дает микроскоп, определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. Кроме светопольной микроскопии широкое применение в специальных методах исследования плучили: темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная (флюоресцентная) и электронная микроскопия.

М етод светлого поля в проходящем свете применяется для изучения прозрачных объектов с неоднородными включениями (простейшие и бактерии в жидкостях, тонкие срезы растительных и животных тканей, тонкие полированные пластинки некоторых минералов). При выполнении данного вида микроскопии пучок лучей из осветительной системы проходит сквозь препарат и дает равномерно освещенное поле в плоскости изображения. В свою очередь элементы структуры препарата частично поглощают и отклоняют падающий на них свет, что и обусловливает появление изображения.

Принцип действия рефрактометра основан на явлении

2. Закон преломления света описывает случаи,

3. Астигматизм — это такой недостаток оптической системы, при котором сферическая волна

преобразуется в эллиптическую волну

не деформируется и остается сферической

деформируется и перестает быть сферической волной.

4. Блеск драгоценных камней можно объяснить на основе явления

полного внутреннего отражения

5. Явление полного внутреннего отражения используется в приборах (выберите правильные ответы)

6. В рефрактометре призма Амичи устраняет

полное внутреннее отражение

7. В идеальной центрированной оптической системе используются

С помощью рефрактометра можно измерить концентрацию (выберите правильные ответы)

только прозрачных растворов

только поглощающих растворов

только оптически активных растворов

прозрачных и поглощающих растворов

поглощающих и оптически активных растворов.

В основе действия микроскопа лежит явление

Всякая линза имеет точку, проходя через которую, луч света не изменяет своего направления. Эта точка называется

оптическим центром линзы

главным фокусом линзы

мнимым фокусом линзы.

Для увеличения поля зрения микроскопа, его увеличение необходимо

12. Минимальный размер объекта наблюдаемого в микроскопе определяется

наименьшим разрешаемым расстоянием

13. Минимальный размер объекта в оптическом микроскопе ограничивает

При полном внутреннем отражении света от границы раздела двух сред угол отражения равен:

Предельным углом преломления называется максимальный угол преломления, наблюдаемый при переходе светового луча

из среды, в которой скорость распространения света меньше в среду с большей скоростью света

из оптически менее плотной среды в оптически более плотную

из оптически более плотной среды в оптически менее плотную.

16. Результат действия апертурной диафрагмы

ограничение поля зрения прибора

уменьшение хроматической аберрации

ограничение светового потока, попадающего на прибор

уменьшение сферической аберрации

17. Водитель в тумане лучше видит красный свет, потому, что волны, соответствующие красному свету, рассеиваются

меньше, чем более короткие волны

больше, чем более короткие волны

правильного ответа нет.

18. Шкалу электромагнитных волн разделили на несколько диапазонов, принимая во внимание

только условия возбуждения колебаний

только свойства распространения колебаний

условия возбуждения и свойства распространения колебаний.

19. Естественный свет содержит

все виды волн электромагнитной шкалы

одну длину волны

все виды волн видимого диапазона

20. Отдельный атом излучает волну (выберите правильные ответы)

21. Электромагнитными волнами являются (выберите правильные ответы)

22. По современным представлениям свет представляет собой (выберите правильные ответы)

23. Явления обусловленные волновой природой света (выберите правильные ответы)

24. Оптическое излучение граничит на шкале электромагнитных волн со следующими диапазонами (выберите правильные ответы)

2. рентгеновским излучением

25. Основной характеристикой световых волн является

4.необходимость наличия среды распространения.

26. Частота и длина волны связаны зависимостью, где — скорость света

27. Скорость распространения электромагнитной волны равна скорости распространения

потенциала действия по нервному волокну

28. Формула дифракционной решетки

1.2d∙Sinβ = ± kλ

2.d∙Sinβ = ± kλ

29. Явление наложения когерентных световых волн, в результате которого образуется устойчивая картина их усиления и ослабления называется

30. В зависимости от угла падения через призму Николя проходит луч

Угол вращения поляризованного света для твердых тел зависит только от

природы вещества и толщины слоя.

32. При прохождении света через призму Николя полное внутреннее отражение претерпевает луч

33. Поляризатор – это устройство, предназначенное для

1.вращения плоскости поляризованного света

2. получения поляризованного света

3.анализа степени поляризованного света

4. восстановления темноты поля зрения.

34. Плоско поляризованный свет – это свет, в котором изменение

в определенных плоскостях

в плоскости поляризации 3.в плоскости колебаний

в оптических плоскостях.

3. векторов и .

36. Плоскость поляризации – это плоскость изменения

37. При падении естественного луча на поверхность призмы Николя в ней происходит (выберите правильные ответы)

1. двойное лучепреломление

2. поглощение обыкновенного луча

3. интерференция лучей

4. выход необыкновенного луча

5. поглощение необыкновенного луча

6. выход обыкновенного луча.

38. При движении обыкновенного луча в некубических кристаллах его скорость распространения

зависит от направления

не зависит от направления

зависит от направления и толщины слоя.

39. В положительных оптически активных средах луч, движущийся к наблюдателю,

поворачивается против часовой стрелки

поворачивается по часовой стрелке

может поворачиваться в обоих направлениях.

40. В отрицательных оптически активных средах луч, движущийся к наблюдателю,

3.может поворачиваться в обоих направлениях.

41. Принцип действия сахариметра основан на явлении

42. Закон Малюса выражается формулой

43. Если главные сечения поляризатора и анализатора расположены перпендикулярно, тогда поляризованный свет

пройдет через систему частично

не пройдѐт через систему

полностью пройдет через систему.

44. Закон Брюстера записывается в виде

45. Плоско поляризованный свет можно получить при помощи следующих устройств (выберите правильные ответы)

46. Поляризованный свет от естественного позволяет отличить

система поляризатор – анализатор.

47. Плоскостью поляризации называют

плоскость, в которой расположен вектор напряженности магнитного

плоскость, в которой расположен вектор напряженности электрического поля

плоскость, совпадающую с плоскостью чертежа.

48. Основное назначение поляриметра

1. определение угла поворота плоскости поляризации

определение механических напряжений

вращение плоскости поляризации

исследование дефектов в кристаллах

наблюдение интерференции поляризованного света.

49. Линейно поляризованный свет – это свет, колебания электрического вектора которого, совершаются

1.во всевозможных направлениях

только в одной плоскости

колебания одного направления преобладают над колебаниями других направлений.

50. Скорость распространения необыкновенного луча

не зависит от направления распространения

различна вдоль главной оси кристалла.

51. Показатель преломления для обыкновенного луча является величиной

2 . постоянной.

52. Показатель преломления необыкновенного луча имеет наибольшее значение, когда луч в кристалле идет

1.перпендикулярно к оптической оси

3.параллельно главной оси.

53. Для необыкновенного луча в призме Николя слой канадского бальзама является средой оптически

54. Сахариметр предназначен для измерения

1. показателя преломления

2. оптической плотности вещества

3. угла поворота плоскости поляризации

55. Свойства, соответствующие только поляризованному свету (выберите правильные ответы)

1. свет распространяется в одном направлении

световая волна — поперечная

имеет определенную ориентацию

световые лучи распространяются во взаимно перпендикулярных направлениях

6.вектора Е и Н имеют одинаковую ориентацию.

56. Причиной поворота плоскости поляризации являются следующие факторы (выберите правильные ответы)

изменение концентрации раствора

изменение спектрального состава света

изменение прозрачности среды

усиление интенсивности падающего света.

57. Граница двух диэлектриков — это

анализатор и поляризатор

58. Свойством двойного лучепреломления обладает

4. изотропные среды.

59. Луч света падает на границу двух диэлектриков под углом Брюстера. Плоскость колебаний отраженного луча преимущественно

перпендикулярна плоскости падения

совпадает с плоскостью падения

перпендикулярна плоскости раздела сред.

60. Луч света падает на границу двух диэлектриков под углом Брюстера. Плоскость поляризации отраженного луча преимущественно

Степень проникновения в микромир, его изучения зависит от возможности рассмотреть величину микроэлемента, от разрешающей способности микроскопа. Чаще всего под разрешением микроскопа понимают минимальное расстояние между различимыми объектами.

При превышении увеличения при котором достигается возможное разрешение, границы деталей изображения сливаются. Дальнейшее увеличение изображения образца теряет смысл.

Гораздо более высокое разрешение имеют электронные микроскопы. В 2011 году лучшее разрешение для Растрового электронного микроскопа было 0,4 нм, и лучшее разрешение Просвечивающего электронного микроскопа было 0,05 нм.

Электронная микроскопия

Теоретические основы использования электронов для наблюдения микроскопических объектов были заложены У. Гамильтоном, установившим аналогию между прохождением световых лучей в оптически неоднородных средах и траекториями частиц в силовых полях, а также де Бройлем, выдвинувшим гипотезу о существовании у электрона одновременно корпускулярных и волновых свойств.

При этом, благодаря чрезвычайно малой длине волны электронов, которая уменьшается в прямой зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, теоретически рассчитанный предел разрешения, характеризующий способность прибора отобразить раздельно мелкие, максимально близко расположенные детали объекта, у электронного микроскопа составляет 2-3 Å (Ангстрем, где 1Å=10-10м), что в несколько тысяч раз выше, чем у оптического микроскопа. Первое изображение объекта, сформированное пучками электронов, было получено в 1931г. немецкими учеными М. Кноллем и Э. Руска.

В конструкциях современных электронных микроскопов источником электронов служит металл (обычно вольфрам), из которого после его нагревания до 2500 ºС в результате термоэлектронной эмиссии испускаются электроны. С помощью электрических и магнитных полей формирующийся поток электронов можно ускорять и замедлять, а также отклонять в любых направлениях и фокусировать. Таким образом, роль линз в электронном микроскопе играет совокупность соответствующим образом рассчитанных магнитных, электростатических и комбинированных устройств, называемых «электронными линзами».

Необходимым условием перемещения электронов в виде пучка на большое расстояние является также создание на их пути вакуума, поскольку в этом случае средняя длина свободного пробега электронов между столкновениями с газовыми молекулами будет значительно превышать расстояние, на которое они должны перемещаться. Для этих целей достаточно поддерживать в рабочей камере отрицательное давление приблизительно 10-4 Па.

По характеру исследования объектов электронные микроскопы разделяют на просвечивающие, отражательные, эмиссионные, растровые, теневые и зеркальные, среди которых первые два являются наиболее часто используемыми.

Оптическая схема просвечивающего (трансмиссионного) электронного микроскопа полностью эквивалентна соответствующей схеме оптического микроскопа, в котором световой луч заменяется электронным лучом, а системы стеклянных линз заменяются системами электронных линз. Соответственно, просвечивающий электронный микроскоп состоит из следующих основных узлов: осветительной системы, камеры объекта, фокусирующей системы и блока регистрации конечного изображения, состоящего из фотокамеры и флуоресцирующего экрана.

Все эти узлы соединены друг с другом, образуя так называемую «колонну микроскопа», внутри которой поддерживается вакуум. Другим важным требованием, предъявляемым к исследуемому объекту, является его толщина менее чем 0,1 мкм. Окончательное же изображение объекта формируется после соответствующей фокусировки прошедшего сквозь него пучка электронов на фотопленке или флюоресцирующем экране, покрытом специальным веществом – люминофором (аналогичен экрану в кинескопах телевизоров) и превращающем электронное изображение в видимое.

При этом образование изображения в просвечивающем электронном микроскопе связано главным образом с различной степенью рассеяния электронов различными участками исследуемого образца и в меньшей мере с различием в поглощении электронов этими участками. Контраст усиливают также, применяя «электронные красители» (четырёхокись осмия, уранил и др.), избирательно связывающиеся с некоторыми участками объекта. Устроенные подобным образом современные просвечивающие электронные микроскопы обеспечивают максимальное полезное увеличение до 400000 раз, что соответствует разрешающей способности в 5,0 Å. Выявляемое с использованием просвечивающей электронной микроскопии тонкое строение бактериальных клеток называют ультраструктурой.

В отражательном (сканирующем) электронном микроскопе изображение создается с помощью электронов, отраженных (рассеянных) поверхностным слоем объекта при его облучении под малым углом (приблизительно несколько градусов) к поверхности. Соответственно, образование изображения обусловлено различием рассеяния электронов в разных точках объекта в зависимости от его поверхностного микрорельефа, а сам результат подобной микроскопии предстает в виде структуры поверхности наблюдаемого объекта. Контрастность может быть усилена напылением на поверхность объекта частиц металла. Достигнутая разрешающая способность микроскопов такого типа составляет порядка 100 Å.

Электронный микроскоп. Модель 1960-х годов

В электронной микроскопии для построения изображения вместо световых лучей используется пучок электронов. Это позволяет увеличить разрешающую способность электронного микроскопа по сравнению со световым в сотни раз.

Первый работоспособный прототип электронного микроскопа был построен в 1932 году Э. Руска и М. Кнолль; в 1986 году за эту разработку Руски, вместе с другими разработчиками электронных микроскопов, была присуждена Нобелевская премия по физике. Серийное производство электронных микроскопов было начато в конце 30-х годов.

Преодоление дифракционного предела

Бинокулярный стереомикроскоп. Модель 1970-х годов

Человеческий глаз представляет собой естественную оптическую систему, характеризующуюся определённым разрешением, то есть наименьшим расстоянием между элементами наблюдаемого объекта (воспринимаемыми как точки или линии), при котором они ещё могут быть отличены один от другого. Для нормального глаза при удалении от объекта на т. н. расстояние наилучшего видения (D = 250 мм), среднестатистическое нормальное разрешения составляет 0,176 мм. Размеры микроорганизмов, большинства растительных и животных клеток, мелких кристаллов, деталей микроструктуры металлов и сплавов и т. п. значительно меньше этой величины. Для наблюдения и изучения подобных объектов и предназначены оптические микроскопы различных типов.
В оптической микроскопии в настоящее время сделан прорыв, в результате которого преодолен фундаментальный рэлеевский критерий, заключающийся в том, что минимальный размер различимого объекта несколько меньше длины волны используемого света и принципиально ограничен дифракцией излучения. Это был предел возможному в оптической микроскопии. До недавнего времени нельзя было преодолеть барьер, позволяющий различать структуры с расстоянием между элементами до 0,20 мкм.

Темнопольная и фазово-контрастная микроскопия

Возможность наблюдения микроорганизмов в живом (неокрашенном) состоянии обеспечивается использованием темнопольной и фазово-контрастной микроскопии, требующих использования специальных конденсоров и позволяющих получать черно-белые изображения исследуемых микроорганизмов с возможностями изучения их формы, подвижности, деления и т.д.

Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля, известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. Данный вид микроскопии впервые был предложен австрийскими учеными Р. Зигмонди и Р. Зидентопфом в 1903 г. При его выполнеии объект освещают не снизу, а сбоку, в результате чего прямые лучи от осветителя в объектив микроскопа не попадают и поле зрения остается темным. Подобный тип освещения достигается использованием специального темнопольного конденсора (параболоида или кардиоида) с затемненной центральной частью.

Кроме того, чтобы в объектив не попадали прямые лучи от осветителя, апертура объектива должна быть меньше, чем апертура конденсора (для уменьшения апертуры в обычный объектив помещают диафрагму или пользуются специальными объективами, снабженными ирисовой диафрагмой). В свою очередь объект освещается косыми боковыми лучами и в объектив микроскопа попадают только лучи, рассеянные частицами, находящимися в препарате. Сказанное объясняет, почему при темнопольной микроскопии микроорганизмы выглядят ярко светящимися на черном фоне (рисунок 3). Ограничениями же темнопольной микроскопии является то, что она позволяет увидеть только контуры объекта, но не дает возможности изучать его внутреннюю структуру.

В основе метода фазово-контрастной микроскопии, также предназначенного для наблюдения микроорганизмов в живом (неокрашенном) состоянии лежит иной физический принцип, впервые предложенный Ф. Цернике в1935 году (Нобелевская премия по физике, 1953 г.). Суть его заключается в том, что в обычных условиях при прохождении пучка света через неокрашенный объект, отличающихся от окружающей среды только по показателю преломления, изменяется лишь фаза колебания световой волны, не воспринимаемая человеческим глазом.

Чтобы изображение стало контрастным необходимо превратить фазовые изменения световой волны в видимые амплитудные, что достигается с помощью специального фазово-контрастного устройства. Основными деталями подобного устройства, которое может быть установлено на любом световом микроскопе, являются фазовоконтрастный конденсор и фазовый объектив. Фазовоконтрастный конденсор представляет собой револьверную конструкцию, в которой установлены кольцевые диафрагмы, обеспечивающие освещение препарата полным конусом света и соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов.

В свою очередь фазовый объектив отличаются от обычных тем, что в их главном фокусе расположена фазовая пластинка, имеющая форму кольца и получаемая нанесением солей редкоземельных элементов на объектив. При этом установку освещения проводят так, чтобы весь свет, прошедший через кольцевидную диафрагму конденсора, в дальнейшем прошел через расположенное в объективе фазовое кольцо.

При изучении препарата весь свет, прошедший через его участки, в которых нет каких-либо объектов, без изменений пройдет и через фазовое кольцо, обусловив светлое изображение фона. В свою очередь свет, прошедший через имеющиеся в препарате частицы, например, бактериальные клетки, получит некоторое изменение фазы и, кроме того, разделится на два луча — недифрагированный и дифрагированный.

Недифрагированные лучи, пройдя в дальнейшем через кольцевидную фазовую пластинку в объективе, получат дополнительный сдвиг фазы. Дифрагированные лучи пройдут мимо фазовой пластинки, и их фаза не изменится. В плоскости же полевой диафрагмы окуляра произойдет интерференция (наложение) дифрагированного и недифрагированного лучей, а так как они идут в разных фазах, произойдет их взаимное частичное гашение с уменьшением амплитуды. Благодаря применению этого метода микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов относительно фона резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст).

Фaзoвoму кoнтpacту пpиcущ эффeкт Гaлo — появление светящегося ореола по контуру изображения объекта, что затрудняет изучение cвoйcтв кpaeвыx cтpуктуp наблюдаемых объектов, нaпpимep, не позволяет тoчнo зaмepять углы или расстояния. Для устранения данного недостатка используется вариант фазово-контрастной микроскопии – так называемый «хоффмановский контраст». Другой разновидностью данного метода является аноптральная микроскопия, преимуществами которой являются большая разрешающая способность с выявлением минимальных разностей плотности в неокрашенных препаратах.

Разрешающая способность методов рентгеновской микроскопии практически достигает 100 нм, что в 2 раза выше, чем у оптических микроскопов (200 нм). Теоретически рентгеновская микроскопия позволяет достичь на 2 порядка лучшего разрешения, чем оптическая (поскольку длина волны рентгеновского излучения меньше на 2 порядка). Однако современный оптический микроскоп — наноскоп имеет разрешение до 3—10 нм.

Проекционные рентгеновские микроскопы

Идея просвечивающего электронного микроскопа состояла в замене опорного электромагнитного излучения на электронный пучок. Известно, что для увеличения разрешения микроскопов, использующих электромагнитное излучение, необходимо уменьшение длины волны электромагнитного излучения до ультрафиолетового диапазон вплоть до рентгеновского (длина волны сопоставима с межатомными расстояниями в веществе) и основная трудность состоит в фокусировке ультрафиолетовых и, тем более, рентгеновских лучей.

Сканирующая зондовая микроскопия

Сканирующий зондовый микроскоп — микроскоп для получения изображения поверхности и её локальных характеристик. Процесс построения изображения основан на сканировании поверхности зондом. В общем случае позволяет получить трехмерное изображение поверхности (топографию) с высоким разрешением.

Значение дифракционного предела в оптике и технике

Дифракционный предел накладывает ограничения на характеристики оптических приборов:

Оптическое излучение, его применение в медицине

a) побочной оптической осью

b) главной оптической
осью

c) световым лучом

a) электромагнитная волна

b) поток частиц света — фотонов

c) направление
распространения энергии световой волны

a) наибольшее расстояние
видимое в микроскоп

b) диаметр части пространства,
видимого в микроскоп

c) наименьшее расстояние
между двумя точками, при котором они
воспринимаются

c) не изменяется

a) оптическим центром
линзы

b) главным фокусом линзы

c) мнимым фокусом линзы

d) бесконечное множество

a) рефракция света

b) дифракция света

c) интерференция света.

a) побочным фокусом

b) оптическим центром

c) главным фокусом

a) разрешающей способностью

b) увеличением микроскопа

c) полем зрения микроскопа

a) 1 см

b) 1 м

c) 1 мм

c) поле зрения не зависит от
увеличения микроскопа

a) величина, обратная
увеличению микроскопа

b) величина, обратная
наименьшему разрешаемому расстоянию

c) величина, обратная фокусному
расстоянию

a) оптической силой
линзы

b) разрешающей силой линзы

c) линейным увеличением
линзы

d) разрешающей способностью
линзы

a) полем зрения

b) наименьшим разрешаемым
расстоянием

c) увеличением микроскопа

a) дифракция света

b) дисперсия света

a) с поляриметром

b) с рефрактометром

c) с сахариметром

d) с микроскопом.

a) дисперсия показателя
преломления

c) поляризация света

d) интерференция света

a) скорость распространения
света больше по сравнению с другой

b) показатель преломления
больше по сравнению с другой

c) ) скорость распространения
света меньше по сравнению с другой

a) угла падения

b) угла преломления

c) угла отражения

a) зависимости поглощения
света от концентрации

b) зависимости показателя
преломления растворов от концентрации

c) оптической активности
растворов

a) оптические свойства среды

b) свойства границы
раздела двух сред

a) отражение и преломление
света

b) поглощение света

c) явление оптической
активности.

a) только прозрачных

b) только поглощающих

c) оптически активных

d) любых из указанных.

d) оптически активных.

a) упругие продольные волны

b) упругие поперечные волны

c) электромагнитные
поперечные волны

d) электромагнитные продольные
волны

a) энергия электромагнитного
поля

b) энергия колебательного
движения частиц упругой среды

c) эллиптически поляризованным
светом,

d) естественным светом.

a) частично-поляризованным
светом

b) светом с
эллиптической поляризацией

c) линейно-поляризованным

a) постоянной интенсивностью

b) с единственной плоскостью
колебаний

c) с одной частотой.

a) при его отражении и
преломлении на границе двух диэлектриков

b) при двойном лучепреломлении
в анизотропных кристаллах

c) при рассеянии света

d) при прохождении
света через изотропный
раствор

a) раздваивать падающий на
поверхность вещества луч света

b) поворачивать плоскость
колебаний, прошедшего через них света

c) преобразовывать естественный
свет в поляризованный

a) поляризационных свойств
света

b) оптической активности
некоторых веществ

c) явлении поглощения
света веществом

a) прозрачных растворов

b) окрашенных растворов

c) растворов оптически
активных веществ

a) длины пути, пройденной
светом в веществе

b) концентрации вещества в
растворе

c) показателя преломления
вещества

d) длины волны света

a) вращательная дисперсия
света

b) оптическая активность
вещества

c) дисперсия показателя
преломления

a) прозрачные ткани

b) окрашенные ткани

c) ткани, обладающие
оптической анизотропией

a) поглощает свет

b) является оптически активным

c) является оптически
прозрачным

a) оптической активности вещества в
растворе

b) состояния поляризации света

c) длины волны света.

a) рассеянии света

b) поглощении света

c) дисперсии показателя
преломления

a) коэффициент пропускания

b) оптическая плотность

c) показатель поглощения

a) свойств веществ

b) концентрации раствора

c) толщины слоя раствора

a) длины волны

c) энергии фотонов

a) коэффициент поглощения

c) коэффициент пропускания

a) одинаковой толщине слоев

b) одинаковой оптической
плотности

в) одинаковой концентрации

a) природы вещества

b) толщины слоя вещества

c) частоты света

a) излучательной способностью
вещества

b) оптическим спектром
вещества

c) оптической плотностью
вещества.

a) излучают энергию с
постоянной интенсивностью

b) излучают энергию в виде
фотонов одной частоты

c) не излучают и не
поглощают энергию

a) число фотонов, испускаемых
телом в единицу времени, отнесенное к
единице площади;

b) энергия данного излучения,
отнесенная к единице площади;

c) энергия излучения,
отнесенная к диапазону длин
волн излучения.

a) сплошная белая полоса

b) семь цветных линий от
фиолетовой до красной

c) сплошная радужная
полоса от фиолетового цвета до красного

b) длине волны

c) скорости фотона

a) определения интенсивности
оптического излучения

b) наблюдения спектрального
состава излучений

c) определения преломляющих
свойств веществ.

a) из состояния с большей
энергией в состояние с меньшей
энергией

b) из основного энергетического
состояния в возбуждённое

c) из состояния с меньшей
энергией в состояние с большей энергией

d) высокая спектральная
плотность излучения

a) фокусировки луча

d) высокой мощности излучения

a) площади луча

b) ширине спектра

c) объему рабочего вещества.

b) дифракционной решетки

Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия

Основы люминесцентной микроскопии были заложены А. Келером, обосновавшим принципиальную возможность подобного метода исследования. Первое устройство для его осуществления впервые было создано в 1911 г., однако широкое распространение получило двумя десятилетиями позже, когда для окрашивания препаратов были предложены специальные вещества – флюорохромы, избирательно связывающиеся с определенными структурами клеток (М. Хайтингер, 1933-1935). Чуть позже было предложено коньюгировать флюорохромы с антителами, что положило начало метода иммунофлюоресценции (А. Н. Кунс, 1942). В бывшем СССР наибольший вклад в развитие метода люминесцентной микроскопии и создание отечественной промышленностью люминесцентных микроскопов и устройств, основанных на этом принципе, внес М. Н. Мейсель (1953).

В основе люминесцентной микроскопии (от лат. lumen — свет; греч. micros — малый + skopeo — рассматривать) лежит принцип люминесценции (видимого глазом свечения) микроорганизмов, клеток, тканей или отдельных структур. При этом физические основы возникновения свечения связаны с процессом поглощения определенными молекулами падающего на них света с последующим испусканием квантов с другой (большей) длиной волны (правило Стокса).

Первичная (собственная) флюоресценция возникает без специальной обработки препаратов и присуща ряду биологически активных веществ, таких, как ароматические аминокислоты, порфирины, хлорофилл, витамины А, В2, В1, некоторые антибиотики (тетрациклин) и химиотерапевтические вещества (акрихин, риванол). Вторичная (наведенная) флюоресценция возникает в результате обработки микроскопируемых объектов флюоресцирующими красителями – флюорохромами. Некоторые из этих красителей диффузно распределяются в клетках, другие избирательно связываются с определёнными структурами клеток или даже с определёнными химическими веществами.

Для проведения данного вида микроскопии используются специальные люминесцентные (флюоресцентные) микроскопы, отличающиеся от обычного светового микроскопа наличием мощного источника освещения (ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления или галогеновая кварцевая лампа накаливания), излучающего преимущественно в длинноволновой ультрафиолетовой или коротковолновой (сине-фиолетовой) области видимого спектра.

Данный источник используется для возбуждения флюоресценции, прежде, чем испускаемый им свет проходит через специальный возбуждающий (сине-фиолетовый) светофильтр и отражается интерференционной светоделительной пластинкой, почти полностью отсекающими более длинноволновое излучение и пропускающими только ту часть спектра, которая возбуждает флюоресценцию. При этом в современных моделях люминесцентных микроскопов возбуждающее излучение попадает на препарат через объектив (!) После же возбуждения флюоресценции возникающий свет вновь попадает в объектив, после чего проходит через расположенный перед окуляром запирающий (желтый) светофильтр, отсекающий коротковолновое возбуждающее излучение и пропускающий свет люминесценции от препарата к глазу наблюдателя.

В силу использования подобной системы светофильтров интенсивность свечения наблюдаемого объекта обычно невелика, в связи с чем люминесцентную микроскопию следует проводить в специальных затемненных помещениях.

Важным требованием при выполнении данного вида микроскопии является также применение нефлюоресцирующих иммерсионных и заключающих сред. В частности, для гашения собственной флюоресценции кедрового или иного иммерсионного масла к нему добавляют небольшие количества нитробензола (от 2 до 10 капель на 1 г). В свою очередь в качестве заключающих сред для препаратов могут быть использованы буферный раствор глицерина, а также нефлюоресцирующие полимеры (полистирол, поливиниловый спирт). В остальном при проведении люминесцентной микроскопии применяют обычные предметные и покровные стёкла, пропускающие излучение в используемой части спектра и не обладающие собственной люминесценцией.

Соответственно, важными преимуществами люминесцентной микроскопии являются:

1) цветное изображение;

2) высокая степень контрастности самосветящихся объектов на черном фоне;

3) возможность исследования клеточных структур, избирательно поглощающих различные флуорохромы, являющиеся при этом специфическими цитохимическими индикаторами;

4) возможность определения функционально-морфологических изменений клеток в динамике их развития;

5) возможность специфического окрашивания микроорганизмов (с использованием иммунофлюоресценции).