КАКОЙ МИКРОСКОП УВЕЛИЧИВАЕТ ИЗОБРАЖЕНИЕ ОБЪЕКТА НА ЧТО ВЛИЯЕТ УВЕЛИЧЕНИЕ ИЗОБРАЖЕНИЯ В СВЕТОВОМ И ЭЛЕКТРОННОМ МИКРОСКОПАХ

Растровый электронный микроскоп Zeiss Leo Supra 35

Микрофотография пыльцы позволяет оценить возможности режима ВЭ РЭМ

Микрофотография интерфейса между оксидной (тёмные поля) и металлической (светлые поля) составляющими позволяет оценить возможности режима ОЭ РЭМ

Растровый электронный микроскоп (РЭМ) или сканирующий электронный микроскоп (СЭМ) (англ. scanning electron microscope, SEM) — прибор класса электронный микроскоп, предназначенный для получения изображения поверхности объекта с высоким (до 0,4 нанометра) пространственным разрешением, также информации о составе, строении и некоторых других свойствах приповерхностных слоёв. Основан на принципе взаимодействия электронного пучка с исследуемым объектом.

Современный РЭМ позволяет работать в широком диапазоне увеличений приблизительно от 3—10 раз (то есть эквивалентно увеличению сильной ручной линзы) до 1 000 000 раз, что приблизительно в 500 раз превышает предел увеличения лучших оптических микроскопов.

Сегодня возможности растровой электронной микроскопии используются практически во всех областях науки и промышленности, от биологии до наук о материалах. Существует огромное число выпускаемых рядом фирм разнообразных конструкций и типов РЭМ, оснащённых детекторами различных типов.

Первая микрофотография, полученная на СПЭМ, зафиксировала увеличенный в 8000 раз кристалл оксида цинка (ZnO) с разрешением от 50 до 100 нанометров. Изображение составлялось из растра 400х400 точек и для его накопления было необходимо 20 минут. Микроскоп имел две электростатические линзы, окружённые отклоняющими катушками.

В 1942 году, русский эмигрант, физик и инженер Владимир Зворыкин, работавший в то время в лаборатории Radio Corporation of America в Принстоне в США, опубликовал детали первого сканирующего электронного микроскопа, позволяющего проанализировать не только тонкий образец на просвет, но и поверхность массивного образца. Электронная пушка с вольфрамовым катодом эмиттировала электроны, которые затем ускорялись напряжением 10 киловольт. Электронная оптика аппарата была составлена из трёх электростатических катушек, а отклоняющие катушки размещались между первой и второй линзой. Чтобы обеспечить удобство размещения образца и манипулирования им в конструкции РЭМ, электронная пушка располагалась внизу микроскопа (у этой конструкции была неприятная особенность — риск падения образца в колонну микроскопа).

В 1960 году Томас Эверхарт и Ричард Торнли, изобретя новый детектор («детектор Эверхарта — Торнли»), ускорили развитие растрового электронного микроскопа. Этот детектор, крайне эффективный для сбора как вторичных, так и отражённых электронов, становится очень популярным и встречается сейчас на многих РЭМ.

Принципиальная схема «исторического» сканирующего микроскопа. Начиная с 1980 года, кинескоп, синхронизированный с РЭМ, уступил место устройствам цифрового накопления изображений

Нижеследующий рисунок иллюстрирует принципиальную схему РЭМ: электронный пучок направляется на анализируемый образец. В результате взаимодействия генерируются низкоэнергетичные вторичные электроны, которые собираются детектором вторичных электронов. Интенсивность электрического сигнала детектора зависит как от природы образца (в меньшей степени), так и от топографии (в большей степени) образца в области взаимодействия. Таким образом возможно получить карту рельефа проанализированной зоны.

Тонкий электронный зонд генерируется электронной пушкой, которая играет роль источника электронов, и фокусируется электронными линзами (обычно электромагнитными, иногда электростатическими). Сканирующие катушки отклоняют зонд в двух взаимоперпендикулярных направлениях, сканируя поверхность образца зондом, подобно сканированию электронным пучком экрана электронно-лучевой трубки телевизора. Источник электронов, электронные линзы (обычно тороидальные магнитные) и отклоняющие катушки образуют систему, называемую электронной колонной.

В современных РЭМ изображение регистрируется в цифровой форме, но первые РЭМы появились в начале 1960 годов задолго до распространения цифровой техники и поэтому изображение формировалось способом синхронизации развёрток электронного пучка в кинескопе с электронным пучком в РЭМ и регулировки интенсивности трубки вторичным сигналом. Изображение образца тогда появлялось на фосфоресцирующем экране кинескопа и могло быть зарегистрировано на фотоплёнке.

Взаимодействие электронов с веществом

Виды взаимодействия электронов с веществом

В результате взаимодействия с атомами образца электроны первичного пучка могут передать часть своей энергии электронам образца. В результате такого взаимодействия может произойти отрыв электронов. Такие электроны называются вторичными. Эти электроны обычно обладают небольшой энергией (порядка 50 эВ). Часто электрон первичного пучка обладает энергией, достаточной для появления нескольких вторичных электронов.

Схема РЭМ, оснащённого детектором рентгеновских лучей — «РСМА» (микрозондом)

РЭМ JEOL JSM 6430F

Основа сканирующего электронного микроскопа — электронная пушка и электронная колонна, функция которой состоит в формировании остросфокусированного электронного зонда средних энергий (200 эВ — 50 кэВ) на поверхности образца. Прибор обязательно должен быть оснащен вакуумной системой. Также в каждом РЭМ есть предметный столик, позволяющий перемещать образец минимум в трёх направлениях. При взаимодействии электронов с объектом возникают несколько видов сигналов, каждый из которых улавливается специальным детектором (см. ниже). Соответственно, изображения, продуцируемые микроскопом, могут быть построены с использованием различных сигналов, часто нескольких сигналов одновременно (например, изображение во вторичных электронах, изображение в отражённых электронах, рентгеновское изображение (карта)).

Основные типы сигналов, которые генерируются и детектируются в процессе работы РЭМ:

Все возможные типы детекторов, установленные на одном приборе, встречаются крайне редко.

Детекторы вторичных электронов — первый и традиционно устанавливаемый на большинство РЭМ тип детекторов (в некоторых упрощённых настольных моделях используется только детектор отражённых электронов). В этом режиме разрешающая способность РЭМ максимальна. Из-за очень узкого электронного луча РЭМ обладают очень большой глубиной резкости, примерно на два порядка выше, чем у оптического микроскопа и позволяет получать четкие микрофотографии с характерным трехмерным эффектом для объектов со сложным рельефом. Это свойство РЭМ крайне полезно для понимания поверхностной структуры образца. Микрофотография пыльцы демонстрирует возможности режима ВЭ РЭМ.

Отражённые электроны (ОЭ) — это электроны пучка, отражённые от образца упругим рассеиванием. В зависимости от конфигурации детектора они могут отображать либо композицию (состав) образца, либо его топографию (рельеф поверхности). В композиционном режиме ОЭ часто используются в аналитическом РЭМ совместно с анализом характеристических спектров рентгеновского излучения. Поскольку интенсивность сигнала ОЭ напрямую связана со средним атомным номером (Z) облучаемой в данным момент электронным пучком области образца, изображения ОЭ несут в себе информацию о распределении различных элементов в образце. Например, режим ОЭ позволяет обнаружить коллоидные золотые иммунные метки диаметра 5-10 нм, которые очень тяжело или даже невозможно обнаружить в биологических объектах в режиме ВЭ. Микрофотография поверхности аншлифа металл-оксидной системы демонстрирует возможности режима ОЭ РЭМ. В топографическом режиме ОЭ могут использоваться в условиях, когда традиционные детекторы вторичных электронов не работают, как например в РЭМ с переменным вакуумом.

Характеристическое рентгеновское излучение генерируется, когда электрон пучка выбивает электрон с внутренней оболочки одного из атомов образца, заставляя электрон с более высокого энергетического уровня перейти на нижний уровень энергии с одновременным испусканием кванта рентгеновского излучения. Обработка спектра характеристического рентгеновского излучения позволяет осуществлять качественный и количественный элементный анализ состава образца.

Обычно для получения информации о структуре поверхности используются вторичные и/или отражённые (обратно-рассеянные) электроны. Контраст во вторичных электронах сильнее всего зависит от рельефа поверхности, тогда как отражённые электроны несут информацию о распределении электронной плотности (области, обогащённые элементом с бо́льшим атомным номером выглядят ярче). Поэтому обратно-рассеянные электроны, которые генерируются одновременно со вторичными, кроме информации о морфологии поверхности содержат дополнительную информацию и о составе образца. Облучение образца пучком электронов приводит не только к образованию вторичных и отражённых электронов, но также вызывает испускание характеристического рентгеновского излучения. Анализ этого излучения позволяет определить элементный состав микрообъёма образца (разрешение для массивных образцов обычно не лучше 1 мкм).

Детектирование вторичных электронов

В качестве детектора вторичных электронов используется детектор Эверхарта — Торнли, позволяющий эффективно собирать электроны с энергией порядка 50 эВ.

Детектирование отражённых электронов

Многие РЭМ оснащены высокочувствительным полупроводниковым детектором обратно-рассеянных электронов. Детектор смонтирован на нижней поверхности объективной линзы либо вводится на специальном стержне под полюсной наконечник. Это позволяет путём выбора режима из меню получить изображения топографии поверхности, изображение в композиционном контрасте или в темном поле.

Для анализа элементного состава применяется рентгеноспектральный микроанализ, в котором детектируется характеристическое рентгеновское излучение вещества, возникающее при облучении поверхности образца электронами. Существует энергодисперсионные (EDX или EDS) и волнодисперсионные (WDX) анализаторы.

До настоящего времени используются энергодисперсионные спектрометры с азотным охлаждением, однако в последние годы производители переходят на безазотные детекторы.

Работа при низких ускоряющих напряжениях

Изображение, полученное при ускоряющем напряжении 300 В. Распределение островков клея на липкой бумаге для заметок (Post-It note). Проводящее покрытие не наносилось: подобные деликатные образцы легко повреждаются при напылении покрытий, а также пучком электронов высоких энергий.

Современные микроскопы способны работать при низких ускоряющих напряжениях, до 200 вольт. Приложение замедляющего потенциала позволяет уменьшать ускоряющее напряжение до 10 вольт. Низкие напряжения имеют ряд преимуществ. При низком напряжении можно достичь состояние равновесия, когда количество электронов пучка поглощённых образцом равно количеству электронов, эмитированных образцом. В этих условиях нанесение проводящих покрытий на образец не требуется. При низких напряжениях повреждение образца электронами пучка минимально, что важно для деликатных образцов. И, наконец, при низких напряжениях зона взаимодействия электронов пучка с образцом резко уменьшается, что ведёт к существенному увеличению пространственного разрешения при работе с отражёнными электронами и с рентгеновским излучением.

Часть современных микроскопов оборудована вакуумной системой, способной поддерживать высокий (и сверхвысокий) 10−3 Па вакуум в электронной колонне, и относительно плохой вакуум до 5 — 2000 Па в камере образцов. В результате образец находится в хотя и разреженной, но достаточно плотной для нейтрализации поверхностного заряда, атмосфере (обычно состоящей из паров воды или азота). Молекулы газов ионизируются под воздействием первичных электронов, испускаемых катодом. Образовавшиеся положительные ионы взаимодействуют с электронами, которые накапливаются на образце и нейтрализуют поверхностный заряд.

В результате диэлектрические образцы можно наблюдать без проводящего покрытия. Если микроскоп оборудован также и охлаждающим держателем образцов, то появляется возможность работы с влажными образцами и даже с водой. Например, можно наблюдать непосредственно в микроскопе за растворением и рекристаллизацией поваренной соли (или других кристаллов).

Пространственное разрешение сканирующего электронного микроскопа зависит как от диаметра электронного пучка, так и от размера области взаимодействия электронного зонда с образцом. Размер электронного зонда и размер области взаимодействия зонда с образцом намного больше расстояния между атомами мишени. Хотя разрешение растровых электронных микроскопов уступает разрешению просвечивающих микроскопов, они имеют ряд преимуществ, таких как возможность изучения топографии образца, визуализация сравнительно большой области образца, исследование массивных объектов (а не только тонких плёнок), набор аналитических методов, позволяющих измерять состав и свойства изучаемого объекта.

Как правило, наилучшее разрешение может быть получено при использовании вторичных электронов, наихудшее — в характеристическом рентгеновском излучении. Последнее связано с большим размером области возбуждения излучения, в несколько раз превышающим размер электронного зонда. При использовании режима низкого вакуума разрешение несколько ухудшается.

Проводящие (металлические) образцы обычно не требуют специальной подготовки, и могут быть непосредственно помещены в камеру микроскопа. Если требуется, образцы могут подвергаться очистке. Для обозрения внутренней структуры и (или) использования микрорентгеноспектрального анализа могут быть приготовлены шлифы.

Порошки и наночастицы наносятся на зеркального качества поверхности (стекло, пластик, слюда и др.) в виде взвеси в воде или органическом растворителе. После высыхания жидкости образец может быть использован в микроскопе. Порошки с более крупными частицами могут наноситься на проводящий углеродный скотч.

Непроводящие образцы обычно подвергаются напылению тонкого проводящего слоя для снятия заряда и экранирования падающего пучка от накопленного в объёме материала заряда. Для проводящих покрытий чаще всего используют углерод, золото или сплав золота с палладием. Первый полезен для рентгеновского микроанализа. Напыление золота или сплава на его основе позволяет получать микрофотографии с бо́льшим увеличением и контрастом (чаще всего без собственной визуализации). Если невозможно напыление плёнки на образец, то в РЭМ с переменным вакуумом возможно снятие заряда с образца ионами вводимых в камеру газов (обычно водяные пары или азот). Накопления заряда на образце так же можно избежать при работе при низких ускоряющих напряжениях (обычно порядка 1 кВ).

Биологические образцы должны быть химически зафиксированы, дегидратированы в сериях растворов спирта или ацетона с увеличивающейся от 30-50 % до 100 % концентрацией, затем спирт (или ацетон) должен быть удален из образца в специальном аппарате, в котором спирт замещается на жидкую двуокись углерода, которая переводится в газообразное состояние посредством перехода через критическую тройную точку.

Растровые микроскопы применяются как исследовательский инструмент в физике, электронике, биологии, фармацевтике, медицине, материаловедении, и т. д. Их главная функция — получение увеличенного изображения исследуемого образца и/или изображений образца в различных регистрируемых сигналах. Сопоставление изображений, полученных в разных сигналах, позволяют делать вывод о морфологии и составе поверхности.

Характеристики современного растрового микроскопа

Характеристики растрового электронного микроскопа Magellan XHR SEM

0,8 нм при 15 кВ
 0,8 нм при 2 кВ
 0,9 нм при 1 кВ
 1,5 нм при 200 В

0,8 нм при 15 кВ
 0,9 нм при 5 кВ
 1,2 нм при 1 кВ

Основные мировые производители сканирующих электронных микроскопов

Время на прочтение

Рис. 1. Детский микроскоп «Натуралист» (за неимением лучшего — фото с торговой площадки)

С тех пор прошло более тридцати лет, но о детском увлечении я не забыл. И вот однажды под влиянием приступа ностальгии я решил купить себе такую же игрушку, только чуть посовременнее. Но первый же взгляд на соответствующий раздел Интернет-площадки показал: чего-то я в этой жизни не понимаю. От обилия самый разных устройств, описываемых одним и тем же словом «микроскоп», просто рябило в глазах. И вот вместо пары быстрых щелчков мышкой пришлось плотно сесть и разобраться хотя бы в самых азах современной микроскопии. Результаты ниже.

Предупреждение: обзор не претендует на исчерпывающее описание и рассчитан на энтузиастов-любителей, интересующихся предметом для себя или для детей. Статья не содержит никакой теории, связанной с оптикой, ее в избытке хватает в других материалах.

Типы микроскопов

Существует довольно много самых разных задач, в которых необходимо детально рассмотреть мельчайшие детали объектов – от драгоценных камней и монет до внутренностей живой клетки. От того, что и как нам нужно увидеть, сильно зависят и применяемые методы. Оставим сейчас за кадром самые мелкие объекты типа вирусов или молекулярной структуры вещества и сосредоточимся на более крупных предметах размерами от бактерии и выше. Оптические устройства, применяемые для таких задач, делятся на два больших класса: биологические (компаундные) и стереомикроскопы.

Подробно останавливаться на стереомикроскопах не станем. Замечу только, что, вопреки подсознательным ожиданиям от названия, данный класс устройств предназначен не для создания стереокартинок. Стереомикроскопы используются для обследования сравнительно крупных непрозрачных предметов в отраженном свете: микросхем, камней, насекомых и т.п. Они отличаются сравнительно небольшим оптическим увеличением (40-60-80х, хотя наиболее продвинутые могут иметь даже 200х) и часто снабжены встроенными мониторами либо цифровыми интерфейсами. Источник света находится над образцом. Размеры – от карманных устройств до солидных стационарных установок.

Некоторые стереомикроскопы для промышленных целей даже лишены оптического окуляра и предназначены исключительно для подключения к компьютеру/смартфону через USB/WiFi («цифровые микроскопы»). Такие микроскопы сравнительно дешевы. Если надо как следует рассмотреть таракана, бриллиант или распайку элементов на плате, этот тип устройств для вас. Только помните, что супер-увеличения типа 1600х, которые часто можно встретить в описаниях даже самых дешевых устройств, относятся к цифровому увеличению и даже близко не отражают реальное оптическое. Каково оно? А кто его знает, производители до таких деталей не снисходят.

Рис. 2. Aomekie stereo microscope с увеличением 20х/40х (фото производителя)

Биологические микроскопы

Основной класс устройств, на котором мы сконцентрируемся – то, что называется биологическим микроскопом, в английской терминологии «компаундным» (составным, от compound). Он предназначен для рассматривания тонких прозрачных образцов (срезы тканей, бактерии, микроорганизмы и т.п.) в проходящем свете. Образец подготавливается на предметном стекле, умещаемом на рабочей платформе, источник света – внизу, под образцом.

Следует понимать, что под биологический микроскоп того же таракана засунуть сложно: для мощной оптики, где расстояние между линзой и препаратом составляет буквально десятую долю миллиметра, препарат должен быть очень тонким, плоским и прозрачным, специально подготовленным и, возможно, окрашенным. Обычно это капля или тонкая пленка, размещенная между предметным и покровным стеклом. Под маломощный объектив таракан влезет (фокусное расстояние у них от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров). Однако следует озаботиться хорошим внешним источником света и не стоит рассчитывать на высокую глубину резкости: в каждый момент времени вы сможете отчетливо видеть только определенный слой изображения.

Типовой биологический микроскоп состоит из трех частей: механическая платформа (база, предметный столик, устройства наведения и фокусировки), подсветка и оптическая система.

Рис. 3. Микроскоп Celestron (фото производителя)

Механическая платформа

Механическая часть состоит из основания, на которой монтируются все прочие компоненты, и предметного столика, на котором умещается образец. Очень важной частью механики является система, отвечающая за перемещение предметного столика в трех измерениях – именно так образец подводится в точку фокуса неподвижного объектива. Существуют модели, в которых перемещается объектив, но это редкая экзотика. В устройствах начального уровня механика самая примитивная. Подстройка по высоте (фокусировка) есть только грубая (coarse), перемещение образца в плоскости – пальцами.

В более сложных моделях в дополнение к грубой фокусировке появляется тонкая (fine), а также зажим, перемещающий предметное стекло в горизонтальной плоскости (его подвижная сторона имеет характерный вид полумесяца, ее хорошо видно на изображениях устройств). В наиболее простых микроскопах вертикальное перемещение регулируется разными винтами/рукоятками, в более продвинутых они совмещены на одной оси. В микроскопах без тонкой фокусировки есть реальная опасность раздавить как предметное стекло, так и линзу объектива из-за неловкого движения руки.

Материал корпуса – пластик либо металл. Пластик легче, но и хрупче. Обычно он применяется в мобильных моделях, предназначенных для детей либо полевых лабораторий – там, где важно минимизировать вес. Для стационарных микроскопов используется металл: он не только прочнее, но и менее подвержен вибрациям, которые на высоких увеличениях становятся критичными. Вес металлического микроскопа – 3-4 килограмма.

Исторически база микроскопа состояла из неподвижного основания и подвижного кронштейна, позволяющего менять ориентацию микроскопа относительно вертикали. Это было необходимо не только для комфорта работы, но и для получения качественной подсветки. Однако современные микроскопы имеют монолитное основание с фиксированным углом наклона глазных тубусов, что не всегда удобно. Учтите, что от этого угла прямо зависит комфорт вашей шеи во время работы, так что подбирайте устройство с углом, подходящим именно вам.

Рис. 4. AmScope M500 с простейшим предметным столиком без перемещения в плоскости (фото производителя)

Электрические компоненты

Мало подвести образец в точку фокуса, его надо еще и правильно подсветить. Плохая подсветка приведет к слишком темному или, наоборот, пересвеченному неразборчивому изображению, а также к неоднородному освещению поля.

Исторически для подсветки использовалось вогнутое зеркало, расположенное под отверстием в столике. Однако с его помощью сложно добиться качественного равномерного освещения поля зрения, что критично на высоких увеличениях. Также оно накладывает очень серьезные ограничения по размещению микроскопа относительно источника света, а также на сам источник. Такое зеркало сегодня осталось только в самых примитивных устройствах, обычно в полевых либо детских микроскопах, как в показанном в начале статьи «Натуралисте». Иногда, впрочем, оно может поставляться как дополнительная опция, замещающая основной источник света.

Сегодня для подсветки используются разные виды встроенных в основание ламп. До относительно недавнего времени применялись лампы галогенные или накаливания, но они имели свои проблемы. В первую очередь – из-за того, что свет генерировался тонкой нитью, а проецировать его приходилось на круглое поле, что, опять же, создает проблемы с равномерностью. Однако в современных условиях индустрия широко использует LED-источники света, что проблему сняло.

Запитывается подсветка либо от батареек (такие микроскопы особенно хороши для детей, поскольку их можно повсюду таскать с собой), либо проводом от розетки. Если заказываете проводное устройство за рубежом, помните о переходниках для вилки.

Регулировка подсветки выполняется как интенсивностью лампы, так и световым конденсором под рабочим столиком, имеющим диафрагму и линзу для фокусировки света на образце. В недорогих моделях наиболее распространен конденсор Аббе (Abbe condenser) или его модификации, это название можно часто увидеть в описании микроскопа. Для любительских занятий обычно применяется подсветка вида «светлое поле» (в смысле, прозрачные объекты рассматриваются на ярком белом фоне), хотя есть и другие типы: «темное поле», дающее инвертированное изображение, флуоресцентная подсветка и т.п. Конденсор может быть сменным, позволяя получать в одном и том же микроскопе разные типы подсветки.

Попадаются также модели с дополнительной верхней подсветкой, как на картинке ниже (этакий гибрид биологического и стереомикроскопа), но обычно это удел любительских устройств и малых увеличений: мощные объективы, практически втыкающиеся в покровное стекло, попросту заслоняют верхний свет. На практике уже сорокакратный объектив даже при хорошей внешней подсветке почти ничего не видит, а стократный показывает полный мрак.

Обратите, кстати, внимание: микроскоп на картинке не обладает полноценным конденсором, вместо него – только источник света и диафрагма. На столике присутствуют только самые примитивные зажимы-клипсы для предметного стекла, перемещение препарата в плоскости – пальцами.

Рис. 5. Любительский микроскоп Swift SW150 входного уровня с дополнительной верхней подсветкой (фото производителя)

Оптическая система – объективы

Оптическая система состоит из объективов (смотрят непосредственно на образец) и окуляров (eyepiece, прилегают к глазу).

Объективы, непосредственно рассматривающие образец, монтируются на револьверном диске для быстрой их смены. По нынешним временам они имеют четыре типовых диапазона увеличения: 4-5х (сканирующий объектив, обычно служит для грубой наводки на цель), 10-15х (маломощные линзы), 40-60х (высокомощные) и 90-100х и выше (сверхмощные). Объективы с увеличением выше 100х встречается редко и уж точно не в любительских микроскопах.

Первые три типа («сухие») обычно стандартны для всех моделей, даже для детских. Последний тип объективов встречается в более продвинутых моделях и для получения качественного изображения требует специальной техники использования – иммерсионной. Суть в том, что коэффициенты преломления воздуха и стекла разные для разных длин волн (именно на этом основано разложение белого цвета в спектр). Если между образцом и объективом есть воздух, на стократном увеличении проявляется сильная хроматическая аберрация, снижающая резкость вплоть до полной неразборчивости.

Поэтому для сильных (девяностократных и выше) объективов обычно используется техника погружения (иммерсии) передней линзы объектива в специальное масло, имеющее тот же коэффициент преломления, что и стекло. На покровное стекло наносят каплю масла, в которое непосредственно опускается объектив. После исследования масло с линзы смывается. Такие объективы обычно помечаются словом oil. Могут они использоваться и насухо, но добиться высокой резкости в этом случае невозможно. Масло входит в начальный комплект микроскопа с такими объективами, а также может быть куплено отдельно (из натуральных масел идеально подходит кедровое). Масляную иммерсию нельзя использовать с менее мощными объективами, для которых она не упомянута явно.

Что интересно, еще в середине прошлого века иммерсионными были даже объективы 50х, но с тех пор техника заметно продвинулась вперед. Исторически первой иммерсионной жидкостью являлась обычная вода (техника изобретена еще в начале 19 в.), подходящее масло впервые подобрали ближе к концу того же столетия.

Также стократные объективы могут напрямую упираться в покровное стекло препарата. Защита фронтальной линзы обычно выполняется с помощью специальной пружинящей оправы (слово spring в описании объектива). Несколько раз в описаниях также попадалось слово feather вместо spring, хотя найти определение мне так и не удалось. Для любительских исследований такие объективы избыточны как с точки зрения дополнительной немалой цены, так и с точки зрения затрачиваемых усилий. Особой дополнительной ценности в домашних условиях они не представляют.

Рис. 6. Набор ахроматических объективов фирмы OMAX с типичными мощностями 4х, 10х, 40х и 100х (фото производителя). На стократном объективе хорошо видна пружинящая оправа

Оптическая система – окуляры

Сменные окуляры вставляются в тубусы в верхней части микроскопа и имеют свое собственное фиксированное увеличение, например 10х, 16х, 25х. Чем выше увеличение, тем короче окуляр. Очкарикам типа меня надо держать в уме, что, в отличие от фотоаппарата, работа с окуляром микроскопа в очках крайне затруднена: окуляр должен практически прижиматься к глазу. Вынос зрачка (eye relief) у обычных окуляров составляет 7-13 мм, с очками нужны специальные окуляры с высоким выносом (15-20 мм). Однако это особой проблемы не составляет. В любом случае резкость в микроскопе подстраивается под глаз индивидуально. Даже с самой высокой близорукостью в микроскопе можно видеть резкое изображение. Неудобство только в том, что очки все время приходится снимать и надевать.

Окуляры могут быть широкофокусными (помечаются буквами WF, wide focus). Такой окуляр имеет большую ширину поля зрения, что заметно облегчает работу с широкими препаратами.
Также следует упомянуть линзу Барлоу (Barlow lens). Это дополнительная трехслойная линза, помещаемая в тубус оптического прибора перед окуляром и дающая небольшое дополнительное увеличение. Как правило, в комплекте поставки микроскопа можно встретить линзы Барлоу 2х. Это банальный маркетинговый трюк. Дешевые ахроматические стеклянные (или даже, упаси боже, пластиковые) линзы заметно ухудшают качество изображения, а потому при мощном увеличении бессмысленны. При низких же и средних сочетания объектива и окуляра вполне достаточно.

По количеству окуляров микроскопы делятся на классические монокулярные (один окуляр), бинокулярные (два окуляра, чтобы смотреть обеими глазами) и тринокулярные (третий тубус/порт обычно монтируется вертикально и служит для подсоединения фото- или видеокамеры).

Наиболее прост в использовании монокуляр. К нему очень легко привыкнуть, а проблему он создает единственную – сильную нагрузку на один глаз при расслабленном другом. При долгом использовании это может кончиться неприятными последствиями для зрения.

Бинокулярные микроскопы используются для обоих глаз сразу и создают стереоизображение. Они позволяют регулировать расстояние между окулярами для подгонки под свои зрачки. Также один из тубусов бинокуляра содержит регулировку, позволяющую компенсировать разницу в диоптриях между глазами. Следует держать в уме, однако, что создание цельного изображения при использовании бинокуляра гораздо сложнее, чем с монокуляром, к нему следует привыкать. Кроме того, регулировка имеет свои ограничения по расстоянию между зрачками, так что подстройка под ребенка может оказаться невозможна. Детский микроскоп следует брать монокулярный, да и для эпизодических любительских упражнений бинокуляр особо не пригодится.

Тринокулярные устройства выглядят эффектно и удобно, если речь идет о трансляции изображения наружу одновременно с работой. Однако следует учитывать, что не всегда все три порта могут использоваться одновременно. Встречаются решения, в которых, например, приходится выбирать между одним из глазных тубусов и третьим портом.

Рис. 7. Тринокуляр Omax M837ZL с вертикальным портом для камеры (фото производителя)

Оптическая система – заключение

Суммарная мощность биологического микроскопа вычисляется как произведение увеличений окуляра и объектива. Например, с объективом 40х и окуляром 10х общее увеличение составит 400х. Однако следует учитывать, что для стандартных ахроматических линз добиться четкого изображения на сверхмощном увеличении из-за законов оптики практически невозможно. Начиная с определенного момента, линзы будут только увеличивать уже видимые детали, но не добавлять новые. Максимальное эффективное оптическое увеличение составляет примерно 1500х, а то и меньше, в домашних условиях 1000х – практический потолок. Для более высоких разрешений применяются дорогие апохроматические линзы либо электронные микроскопы, что уже совсем другая песня.

При работе с препаратами также важна правильная установка диафрагмы конденсора. Узкая диафрагма повышает контрастность и резкость, но затемняет изображение. Широкая диафрагма пропускает больше света, но может сделать изображение пересвеченным и малоконтрастным, скрывая детали и даже целые объекты. Подбор диафрагмы для каждого препарата выполняется индивидуально.

На картинке ниже обратите внимание на вращающуюся головку микроскопа, позволяющую ориентировать окуляры в нужном направлении. Такая конструкция удобна при работе нескольких человек. Однако подстраивать резкость под свои глаза каждому все равно придется индивидуально.

Рис 8. Бинокулярный микроскоп Motic BA80 (фото производителя). Под столиком в центре хорошо виден конденсор, на столике – месяцевидный зажим для предметного стекла

Оптическая система – сопряжение микроскопа с компьютером

Подключение микроскопа к внешним устройствам, таким как монитор или компьютер, выполняется за счет установки специальной видеокамеры *вместо* окуляра или в выделенный порт тринокуляра. Следует держать в уме, что в этом случае теряется увеличение, даваемое окуляром, остается только увеличение объектива и нерегулируемых линз камеры. В параметрах камер обычно указывается только емкость ее матрицы (3, 5, 10 и более мегапикселей), оптическое увеличение остается тайной за семью печатями. Кроме того, поле зрения камеры существенно уже, чем у человеческого глаза.

Сама по себе камера может не распознаваться стандартными средствами Windows и приложений (и не надо – без микроскопа она полностью слепа), так что производители прилагают к ней специализированный софт. Он позволяет как делать фотографии, так и записывать видео. На рынке есть разные виды камер – от стареньких с разрешением 640х480 до современных с разрешением аж до 20 мегапикселей. Отличаются они также интерфейсами, что влияет на возможности записи видео в первую очередь (получение видеопотока с высоким FPS и разрешением через USB 2.0 будет затруднительно). Также камеры могут подключаться напрямую к монитору или иному устройству через HDMI, иметь WiFi-интерфейс и т.п.

Многие производители предлагают для своих микроскопов также и камеры, но никто не мешает купить камеру от другого вендора. Следует только учитывать, что диаметр тубуса у разных микроскопов может отличаться, так что следует удостовериться, что данная камера подходит для данного тубуса. Ну, или использовать переходники, которые тоже продаются. Стандартный диаметр для окуляра биологического микроскопа – 23,2 мм, стереомикроскопа – 30 и 30,5 мм.

Существуют также относительно дешевые насадки, позволяющие перенаправлять оптический поток из окуляра в объектив камеры смартфона. Плюс такого устройства – сохранение оригинального увеличения, поскольку монтируются они поверх окуляра. Минус – возможности получения и сохранения изображения ограничиваются невеликими возможностями смартфона. Ну, и поле зрения у такой камеры все равно уже, чем у глаза.

Рис. 9. Цифровая камера для микроскопа Puls Life Science DCM-310 (фото производителя)

Цены и производители

Цены на биомикроскопы можно найти самые разные. Те, что позиционируются для детей, попадаются и за 30-40 евро, однако следует помнить о возможных ограничениях типа фиксированного окуляра 10х, не поддерживающего установку камеры, отсутствия конденсора, а то и вообще подсветки, примитивном предметном столике и т.п. В Европе можно купить монокулярные микроскопы с тремя объективами, рассчитанные на энтузиастов и студентов, их ценовая категория – от 100 евро. Камера для микроскопа – от 50 евро (и далее в космос: двадцатимегапиксельная может стоит и семь сотен). Более профессиональные микроскопы – би- и тринокуляры со стократными объективами – стоят от 250 евро. Наконец, многие вендоры предлагают комплекты, специально рассчитанные на детей, студентов и энтузиастов. В них могут входить монокуляр входного уровня, простенькая видеокамера, базовый набор инструментов и предметных стекол и т.п. Цены на такие комплекты начинаются от полутора сотен евро.

К покупке следует обязательно добавить минимум один набор из предметных и покровных стекол (от 8-10 евро – учтите, это расходный материал), а также, по желанию, набор заранее подготовленных препаратов (крылья, ноги, хвосты, листики и подобные нехитрые препараты для вхождения в тему). Ну, а дальше – скальпели, пинцеты, микротомы, чашки Петри, пробирки, препараторские иглы и так далее, и тому подобное в зависимости от ваших увлечений. Также обязательно купите изопропиловый спирт (чем выше концентрация, тем лучше), кисточки, продувки, салфетки из микрофибры и т.п. – оптика имеет свойство пачкаться и пылиться, а даже отдельные пылинки на линзах микроскопа отобьются пятнами на изображении.

Учитывайте также, что цены на одни и те же товары на американском, английском и немецком Амазонах, не говоря уже про eBay, могут очень существенно различаться, так что после выбора модели стоит порыться на разных площадках в поисках цены пониже. Также можно искать микроскопы на Алиэкспрессе. Однако хотя там цены заметно ниже, чем в Европе, цена на доставку оказывается сопоставима с ценой самого микроскопа, что полностью лишает затею смысла.

Какой бренд выбрать? Поскольку оптика для микроскопов критично важна, на этом рынке отметились крупные мировые производители, связанные с оптикой – Олимпус, Цейс, Лейка, Никон и так далее. Однако цены на их устройства даже входного уровня, мягко говоря, не радуют, да и в розницу они могут просто не работать. Так что любителю стоит приглядеться к более демократичным вендорам, таким как Swift, Bresser, Omax или AmScope. Также можно приобрести отдельные объективы и окуляры, в том числе китайского производства (есть неплохие, судя по отзывам), но в этом случае нужно удостовериться что они совместимы с микроскопом. Европейский стандарт, определяющий резьбу и прочие механические и оптические параметры, называется DIN.

Немного практики. Игрушка в реальности

После месяца мучительных раздумий, в которых детское «хочу!» отчаянно боролось с взрослой скупостью и рационализмом, я остановился на бинокуляре Swift 350B. Почему? Ничего особенного: микроскопы Swift при умеренных ценах имеют качество, подходящее даже для лабораторных условий. Плюс на осенней распродаже на английском Амазоне эта модель продавалась всего за 160 фунтов. Чтобы два раза не вставать, вторым компонентом покупки стала трехмегапиксельная камера Swift стоимостью 80 фунтов.

Выглядит комплект поставки микроскопа примерно так:

Четыре объектива (4х, 10х, 40х и 100х) уже установлены в револьверное кольцо, наборы окуляров (10х и 25х) вложены отдельно. Обратите внимание на пустую вертикальную выемку над головкой и два пустых гнезда – упаковка универсальна и рассчитана в том числе на тринокуляры. Шнур/гнездо питания – C13/C14, блок питания встроен в основание. В комплект входит простенький пластиковый чехол а-ля «мешок мусорный обыкновенный».

В сборе и с подключением к ПК выглядит так (на мониторе – транслируемое с микроскопа изображение пчелиной ноги):

Теперь посмотрим, как выглядят образцы с разным увеличением при трансляции с камеры. Начнем с препарата листа флокса (поперечный срез) из продаваемого набора образцов. Использованы объективы 4х, 10х, 40х и 100х (без масла).

Как видно, без иммерсии стократный объектив ничего внятного не показывает. Сорокакратный показывает, но из-за малой глубины резкости приходится выбирать, какой слой препарата рассматривать. Поскольку вместо окуляра использована оптика камеры, финальное оптическое увеличение я определить затрудняюсь. Для сравнения: на снимке ниже то, что видит камера сотового телефона через окуляр 25х и объектив 4х (итоговое увеличение 100х). Снималось с рук, поскольку держатель для телефона я не купил, отсюда обрезанность по бокам.

Можно предположить, что камера дает увеличение 20-25х, но какова его часть оптическая, а какова цифровая, определить сложно.

Второй препарат – сделанный самостоятельно. Просто капля воды из кухонной раковины под покровным стеклом без какой-либо подготовки. Объективы те же: 4х, 10х, 40х.

Обратите внимание на радужную кайму по границе капли (дугообразная черная линия на втором и третьем снимках). Если на 4х аберраций не видно никаких, то на 10х уже появляется слабое искажение цветов на границах объектов. На 40х радуга становится настолько заметной, что отчетливо видна даже на снимке камеры и заметно ухудшает резкость. Именно для ликвидации такого эффекта стократные объективы погружают в масло.

Для сравнения: что видит камера смартфона через окуляр при с комбинацией 4х * 25х:

Напоследок пара слов о стеклах. Препарат, помимо наблюдаемого объекта, состоит из толстого предметного стекла и тонкого покровного. Предметное стекло кладется на столик, покровное обращено к окуляру. Следует быть чрезвычайно осторожным при работе с покровными стеклами: при толщине 0,13-0,17 мм они имеют весьма острые грани, несмотря даже на специальную их обработку. При неаккуратном обращении они могут запросто распластать вам палец, а то и сломаться в ране. Ни в коем случае не позволяйте работать с ними малым детям, да и подростков тоже следует проконтролировать на начальном этапе.

По окончании работы с препаратом следует либо как следует очистить и обезжирить стекла. Остатки жира и масла приведут к тому, что капля будет не растекаться по стеклу, а разбиваться на еще более мелкие капли, затрудняя рассмотрение. В лабораториях применяются разные методы обезжиривания, но они небезопасны и требуют специальных химикатов, зачастую ядовитых, и оборудования типа вытяжек. В домашних условиях наиболее простой способ – изопропиловый спирт либо получасовое кипячение на медленном огне в растворе 2-5% растворе пищевой соды (примерно чайная ложна на 100 мл). Грязное покровное стекло, скорее, проще выбросить – оно слишком хрупкое и легко ломается. Да и за предметные стекла тоже особо держаться не стоит – это дешевый расходный материал. Иммерсионные объективы от масла чистятся так же, как и любая другая оптика: изопропиловым спиртом на микрофибре.

На этом введение в основы оптической микроскопии закончены. Успехов в самостоятельном плавании.