КОГДА БЫЛ ИЗОБРЕТЕН ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП

1937 г.

Разработаны современные электростатические фотоэлектронные умножители, далее для краткости — ФЭУ. Разработка ФЭУ в США велась корпорацией RCA, в которой также работал и В. Зворыкин над электронным микроскопом.

Пример ФЭУ с подключённой электроникой. Тот самый ФЭУ производства RCA, тип 4517.

ФЭУ — это очень чувствительное устройство, пригодное для регистрации отдельных фотонов. Его коэффициент усиления составляет порядка 100 миллионов.

Принцип действия очень простой. Через входное окно из кварцевого стекла фотоны попадают на фотокатод.

Фотокатод эмитирует электроны, которые летят к специальным электродам — динодам, расположенным последовательно. Коэффициент вторичной эмиссии динодов больше единицы: влетел один электрон, а вылетело больше одного. Таким образом получается лавинообразное увеличение количества электронов, которые в конце достигают анода, с которого и снимается полезный сигнал. Между динодами поддерживается разность потенциалов с помощью резистивного делителя, поэтому ФЭУ и называется электростатическим.

В этом ФЭУ диноды расположены нелинейно:

1935 г.

Ток луча измерялся микроамперами, поэтому можно было усиливать сигнал с проводящего образца с помощью уже разработанных тогда электронных ламп. Вот так и появился детектор поглощённого тока (absorbed current / specimen current).

На самом деле Knoll получил настоящее изображение во вторичных электронах. Потому, что поглощённый образцом ток — сколько электронов в него ударилось (сканирующий луч) минус те, что отлетели или были вторично эмитированы.

Увеличение варьировалось от 1х до 10х путём изменения амплитуды колебаний электронного луча в микроскопе (что кстати ранее продемонстрировал В. Зворыкин в оптическом микроскопе, оснащённом телевизионной камерой). Для получения большего увеличения нужно уменьшать диаметр луча.

Отличие от световой микроскопии

Отсюда диаметральная противоположность световой и электронной микроскопий: если в световой нужно увеличить изображение образца (просвечивающее или отражённое), то в электронной нужно как можно сильнее уменьшить изображение источника излучения. Исключение составляют лишь просвечивающие электронные микроскопы, но об этом я уже писал.

1947 г.

Palluel опубликовал работу, в которой экспериментально показал зависимость эмиссии упругоотражённых электронов от атомного номера элемента для электронного луча энергией 20кэВ. Чем больше номер, тем больше эмиссия электронов. Это явилось достаточно важным открытием, но получить первое изображение с контрастом по атомному номеру удалось лишь в 1957 г.

В настоящее время с развитием полупроводниковых детекторов отражённых электронов получить такой контраст не составляет труда. Вот, например, фотография из прошлого видео про антимонид галлия:

Даже при ускоряющем напряжении 15кВ композиционный контраст сильно заметен.

1942 г.

В тоже самое время над электронным микроскопом работал Владимир Зворыкин. Он сконструировал сканирующий электронный микроскоп в современном его понимании: электронно-оптическая колонна, камера с образцом, вакуумная система. Сканирование по стандарту на ТВ в то время в США: 441 строка, 30 кадр/с. Но при уменьшении диаметра луча меньше 1 микрона ток становился слишком маленьким и в результате усиления был только шум.

Следующей попыткой было увеличить ток луча и применить катод с полевой эмиссией. Для этого опять пришлось вернуться к запаянной стеклянной трубке забыв о смене образцов. Зато удалось экспериментально получить увеличение 8000х.

Вновь вернувшись к сканирующему электронному микроскопу с отключаемой вакуумной системой, Владимир Козьмич предложил следующее решение:

Расположить люминисцентный экран рядом с образцом, а уже затем детектировать испускаемые им фотоны с помощью ФЭУ (разработкой ФЭУ занималась та же компания, в которой работал Зворыкин).

Преимущество этого решения с двойным преобразованием (электроны — фотоны — электроны) в том, что можно уменьшить скорость сканирования и таким образом увеличить соотношение сигнал/шум до необходимого.

Отсюда пошёл режим медленнего сканирования (slow scan), который есть и в современных электронных микроскопах. Но из-за этого режима изображение больше не выводилось в реальном времени, а записывалось специальным факсимильным аппаратом (видимо, производства той же фирмы). И опять возникает та же проблема с настройкой фокуса, но решение ещё раньше предложил von Ardenne: наблюдая одну линию сканирования на осциллографе настраивать фокус так, чтобы преобладали высокие частоты.

Интересно то, что образец имел потенциал +800В, катод был заземлён, а электроны ускорялись анодом до 10кэВ. Таким образом, в люминисцентный экран электроны врезались с энергией 9.2кэВ. Нужно это было для работы четвёртой, иммерсионной электростатической линзы, которая должна была влиять только на вторичные электроны, а не исходный луч.

Для исследования объектов разного типа, и в зависимости от требуемой величины оптического разрешения и других требований, созданы разные микроскопы:

Увидеть незримое и почувствовать неосязаемое. На что еще способен электронный микроскоп?

Время на прочтение

Перед вами небольшой обзор на электронные микроскопы и их возможности.

Изображение вируса Эбола, полученное при помощи просвечивающей электронной микроскопии

Несмотря на то, что «электронная микроскопия» звучит очень современно, запатентована она была еще в 1931 году германо-американским инженером и изобретателем Райнхольдом Руденбергом. Это был настоящий переворот в области изучения микроструктур.

▎В чем суть электронной микроскопии?

А вот недостатков много:

Теперь давайте рассмотрим основные виды электронной микроскопии.
А основных видов два:

Нитчатая водоросоль в световом микроскопе (а), СЭМ (б) и ПЭМ (в)

▎Просвечивающий электронный микроскоп

Вирус свиного гриппа в просвечивающим электронном микроскопе

Фокусировка электронного потока осуществляется при помощи электромагнитных и электростатических линз. Возникают даже присущие фотонным микроскопам хроматические аберрации. Только природа такого искажения абсолютно иная. Кроме того, за счет закручивания электронов вдоль оси пучка в линзе, возникают дополнительные искажения.

Из недостатков: объект, помещаемый в ПЭМ, должен быть не толще 1 микрона, то есть как один слой волоса, разрезанного вдоль на 50 частей. А вторая проблема — размер. П ЭМ занимает целую комнату: высотой в человеческий рост и с блоком питания, размером со шкаф.

ㅤㅤㅤПросвечивающий электронный микроскоп

▎Сканирующий электронный микроскоп

ㅤㅤСканирующий электронный микроскоп

У СЭМ есть несколько принципиально разных режимов работы, которые зависят от детекторов.

Рассмотрим основные виды:

• Детектор вторичных электронов

Используется для определения морфологии поверхности образца, поскольку сигнал вторичных электронов высокочувствителен к рельефу, шероховатостям и неровностям. Чаще всего данный режим работы используется в биологии для определения пор, борозд и изломов, к примеру, при изучении бактериальной клетки.

Изображение пыльцы, полученное путем детектирования вторичных электронов

• Детектор обратно отраженных или обратно рассеянных электронов

Используется для определения состава разносоставного вещества со множеством включений, поскольку сигнал рассеянных электронов чувствителен к специальному композиционному контрасту. Таким образом, на получаемом изображении, вещества разного состава в одном объекте будут иметь разные оттенки серого. Данный режим применяется, в основном, в кристаллографии и биологии.

Морфология интерфейса между оксидной и металлической составляющими, сделанная в режиме детектирования отраженных электронов

• Энергодисперсионный спектрометр

Позволяет определить элементный состав веществ и включений исследуемого образца. Конечно, в большинстве случаев важнее определить химический, а не элементарный состав. Зато энергодисперсионный спектрометр позволяет точечно, для каждого микрокомпонента определить состав. Кроме того, для данного метода не требуется никаких реагентов. Используется в химии и кристаллографии.

Анализ элементного состава микрокомпонентов полированного образца анодного шлака с помощью энергодиспрсионного спектрометра

• Детектор прошедших электронов

Электроны, прошедшие тонкий срез образца насквозь, приходят к датчику под разным углом, что дает различную информацию об исследуемом объекте. Угол рассеивания зависит от толщины среза, материала образца и энергии первичного электронного пучка. Детектор передает псевдоцветное изображение, где каждый цвет соответствует своему сигналу.

Коррозия, распространяющаяся сквозь хромовое покрытие на стали. Изображение получено при помощи детектирования прошедших электронов.

• Детектор катодолюминесцентного излучения

Используется при изучении материалов, обладающих люминесценцией, то есть способные излучать видимый свет при попадании на них электронного потока.

Изображение циркона, полученное
при детектировании катодолюминесцентного излучения

СЭМ может работать исключительно с твердыми образцами в вакууме. Поэтому для работы с жидкостями, их необходимо подвергнуть глубокой заморозке. Зато форма и размер образца могут быть любыми в пределах объема рабочей камеры. Продуктивность работы повышается при нанесении на исследуемый образец тонкого слоя токопроводящего материала.

Электронная микроскопия применяется во многих сферах науки и промышленности:

Биология и медицина

При помощи ЭМ можно осуществить томографию тканей, детально рассмотреть клетки, определить локализацию белков, увидеть вирус и даже выполнить фармацевтический контроль качества.

Физика, химия и кристаллография.

ЭМ позволяет изучить микроструктуры металлов и кристаллов вещества, классифицировать материалы, тестировать характеристики различных веществ, определять состав, поверхность и плотность объектов.

Полупроводники и хранение данных

С помощью ЭМ выявляются и редактируются неисправности систем, выполняется анализ дефектов.

ЭМ помогает определять параметры частиц и целых структур. Позволяет в динамике посмотреть на материалы в высоком разрешении. При необходимости дает возможность построения трехмерной модели микроструктуры.

▎3D моделирование

Это возможно осуществить несколькими способами:

1. П ЭМ серийных срезов

Самый первый из подходов к трехмерному моделированию на электронном микроскопе. Способ заключается в создании ленты ультратонких срезов, которые собираются на специальной сетке, покрываемой углеродом и особым веществом —  формваром. Полученные изображения обрабатываются в специальной программе: создается контур, фотографии выравниваются, обрезаются и сводятся в одно трехмерное изображение. Процесс сведения трудоемкий и занимает очень много времени, а размеры изображения ограничены. Еще одной проблемой являются существенные зазоры между слоями. Кроме того, ультратонкие срезы очень хрупкие и подвержены повреждениям. И чем их больше, тем выше шанс деформации образца.

2. Криоэлектронная томография

По сравнению с ПЭМ серийных срезов, позволяет увидеть в более высоком разрешении более мелкие структуры, величиной от 3 нм, к примеру, элементы цитоскелета. Однако образцы должны быть довольно мелкими (100—500 нм) поэтому КЭТ не применима для крупных объектов и подходит только для молекулярных комплексов, вирусов и мелких бактерий.

Принцип метода криоэлектронной томографии

В процессе КЭТ объект исследования постепенно поворачивается и изображения получаются под разным углом наклона. После этого все фотографии сводятся в одно 3D изображение. Минус метода в том, что образец получает высокую дозу излучения, за счет чего часть мелких деталей теряется в процессе исследования.

3. Многоэнергетическая деконволюция

При помощи этого метода можно получить несколько изображений образца на разной его глубине, не разрушая поверхности объекта. Такой эффект достигается за счет изменения ускоряющего напряжения электронов. И чем выше энергия, тем глубже в объект может проникнуть электрон. Каждое изображение будет давать характеристику определенного слоя. А специальный программный алгоритм соберет множество срезов в трехмерную модель с максимальным разрешением до 10 нм. Помимо прочего, данный метод можно использовать совместно с методом ультратонких срезов.

4. Фокусирующая ионно-лучевая сканирующая электронная микроскопия (ФИЛ-СЭМ)

Суть метода заключается в параллельном «разрезании» исследуемого образца на слои пучком ионов галлия и сканировании объекта электронным пучком. Слой получается толщиной 5—10 нм. Полученные изображения собираются в единую трехмерную модель.

Раскрашенное изображение бактериофагов
(зеленые), поразивших кишечную палочку (голубые), сделанное в ФИЛ-СЭМ

Сложность метода в подготовке. Перед проведением операции необходимо защитить образец от части заряда. Для этого на сам объект, к примеру, кусок органа, напыляется металл, а блок, в который заключен образец, покрывается серебряной пастой. Максимальный размер моделируемого объекта — 100*100 мкм. Кроме того, метод очень долгий, а с увеличением глубины резки снижается качество.

Принцип метода ФИЛ-СЭМ

5. С ЭМ с автоматизированной лентой для сбора срезов

По сути, это улучшенная версия метода серийных срезов. Специальная насадка на ультрамикротом, который делает срезы, работает автоматически и способна делать до 1000 срезов в день, помещая их на специальную ленту. Далее лента разрезается на фрагменты, кладется на подложку, срезы обрабатываются контрастом и углеродом, после чего разрезанный образец помещается в СЭМ. Полученные изображения имеют разрешение 5 нм.

Ультрамикротом со специальной насадкой и вставленной лентой для срезов

6. Последовательная сканирующая электронная микроскопия поверхности блока

Используется для получения трехмерной модели большого объекта. Для этого ультрамикротом помещается внутрь СЭМ. В процессе происходит последовательное срезание ультратонких слоев образца с последующим сканированием. Для улучшения изображения может использоваться контраст. Преимущество данного метода заключается в величине объекта и скорости обработки информации. За получаемыми данными можно наблюдать в реальном времени.

▎Цветное изображение

Коррелятивная свето-электронная микроскопия элементов цитоскелета

Ученые объединили КСЭМ с трехмерной световой микроскопией, уже известной нам ФИЛ-СЭМ и с микроскопией сверхвысокого разрешения (СР-микроскопия), которая позволяет получить большее разрешение за счет объединения на экране множества снимков.

Срез ядер нейронов при микроскопии сверхвысокого разрешения

Составив изначально изображение высокого разрешения, ученые резали образец лучами ионов. Изображение получало цвет за счет световой микроскопии структурированного освещения, позволяющего увеличить разрешение снимка в два раза за счет поочередной подсветки отдельных точек при фоновом свечении остального образца, и одномолекулярной световой микроскопии, при которой флуоресценция красителя активируется слабым лазером. Одномолекулярная микроскопия позволяет получить изображение с разрешением 0,2 мкм. Все полученные изображения свели вместе и получили полноценные цветные снимки. С помощью данной методики удалось разглядеть, к примеру, ультраструктуру нейронов.

Трехмерные модели ядер нейронов, полученные при коррелятивной микроскопии

История создания электронного микроскопа

В 1931 году Р. Руденберг получил патент на просвечивающий электронный микроскоп, а в 1932 году М. Кнолль и Э. Руска построили первый прототип современного прибора. Эта работа Э. Руски в 1986 году была отмечена Нобелевской премией по физике, которую присудили ему и изобретателям сканирующего зондового микроскопа Герду Карлу Биннигу и Генриху Рореру. Использование просвечивающего электронного микроскопа для научных исследований было начато в конце 1930-х годов и тогда же появился первый коммерческий прибор, построенный фирмой Siemens.

В конце 1930-х — начале 1940-х годов появились первые растровые электронные микроскопы, формирующие изображение объекта при последовательном перемещении электронного зонда малого сечения по объекту. Массовое применение этих приборов в научных исследованиях началось в 1960-х годах, когда они достигли значительного технического совершенства.

Значительным скачком (в 70-х гг) в развитии было использование вместо термоэмиссионных катодов — катодов Шоттки и катодов с холодной автоэмиссией, однако их применение требует значительно большего вакуума.

В конце 90х — начале 2000х компьютеризация и использование CCD-детекторов значительным образом увеличили стабильность и (относительно) простоту использования.

В последнее десятилетие в современных передовых просвечивающих электронных микроскопах используются корректоры сферических и хроматических аберраций (что вносят основное искажение в получаемое изображение), однако их применение порой значительно усложняет использование прибора.

Лазерная рентгеновская микроскопия

См. Лазерный рентгеновский микроскоп

Лазерный рентгеновский микроскоп (ЛРМ) использует принцип лазерного луча свободных электронов установки (FEL), которая произвела инфрокрасный луч с длиной волны 1,61 микрона мощностью 14,2 киловатта. В 2004 году Американский национальный центр ускорителей — лаборатория Джефферсона (Thomas Jefferson Lab, National Accelerator Facility) на установке FEL лазерный луч формировала в вигглере.

Принципиальная схема работы лазерного рентгеновского микроскопа

Рис. 1, Принципиальная схема работы Лазерного рентгеновского микроскопа

Из Рис.1: ‎

Рис.2,Схема Лазерного рентгеновского микроскопа будущего

Таймлайн развития электронной микроскопии

Эта статья — продолжение серии материалов про электронный микроскоп в гараже. На всякий случай вот ссылка на первый выпуск.

Наш проект подошёл к тому этапу, когда нужен детектор (электронов, вторичных или упруго-отражённых). Но прежде расскажу вам, зачем именно этот детектор нужен и как учёные пришли к его современной конструкции.

Для наглядности сделаем это в виде таймлайна.

В следующих сериях

Теперь можно самостоятельно изготовить детектор Эверхарта-Торнли для нашего JEOL’а, усилитель поглощённого тока, и попробовать сделать полупроводниковый детектор отражённых электронов.

Электронные микроскопы дороги в производстве и обслуживании, но общая и эксплуатационная стоимость конфокального оптического микроскопа сравнима с базовыми электронными микроскопами.
Микроскопы, направленные на достижение высоких разрешений, должны быть размещены в устойчивых зданиях (иногда под землёй) и без внешних электромагнитных полей.
Образцы в основном должны рассматриваться в вакууме, так как молекулы, составляющие воздух, будут рассеивать электроны.

С момента первой публикации прошёл один год. За это время удалось очень многое узнать, во многом разобраться, и поделиться этим с вами. Познакомиться с очень интересными людьми, которые сильно помогли проекту. И, написать десять статей про электронный микроскоп в гараже.

С наступающим Новым Годом!

1. П.Хокс. Электронная оптика и электронная микроскопия. Москва 1974.
2. T HE SCANNING ELECTRON MICROSCOPE. A Small World of Huge Possibilities.
3. S CANNING ELECTRON MICROSCOPY 1928 — 1965. D. McMullan, Cavendish Laboratory, University of Cambridge, UK.
4. www.rfcafe.com/references/radio-craft/scanning-electron-microscope-september-1942-radio-craft.htm
5. Быков Ю. А., Карпухин С. Д. Растровая электронная микроскопия и рентгеноспектральный микроанализ. Учебное пособие. М ГТУ им. Н.Э. Баумана.

Разрешающая способность микроскопов

Получение изображений осуществляется путём использования соответствующих оптических систем — Микроскопов.

Степень прониковения в микромир, изучения микромира зависит от возможности рассмотреть величину микрообъектов, от разрешающей способности прибора , определяемой длиной волны используемого в микроскопии опорного излучения (свет, УФ, ИК, рентгеновское излучение). Главным ограничением возможности рассматривать более мелкие частицы — это когда достигнут предел возможности применить длину опорной (например,размер площади) волны излучения (освещения) объекта меньше его (т.е. внутри его границ). Например, наш глаз спослбен рассмотреть размер пятен изображения или две риски в пределах 0,176мм c расстояния 250мм. Уменьшение размероав пятен или расстояний между рисками мы воспринимаем как сплошное любое цветное или чёрно-белое (серое) изображение без видимых деталей. Т.е. «проникнуть глубже» в микромир возможно при применении более коротковолновых излучений, т.е. излучений с меньшими длинами волн, соответственно с более высокой разрешающей способностью микроскопов. В настоящее время достигнут предел разрешающей способности микроскопа или микроскопии, равный длине опорной волны луча «жёсткого» рентгеновского излучения, что соответстыет длинам волн 1—10нм (10−9—10−8м) .

Человеческий глаз представляет собой естественную , характеризующуюся определённым разрешением, т. е. наименьшим расстоянием между элементами наблюдаемого объекта 0,176 мм c расстояния 250мм. Размеры микроорганизмов, большинства растительных и животных клеток, мелких кристаллов, деталей микроструктуры металлов и сплавов и т. п., наконец атомов и молекул значительно меньше этой величины.

Для наблюдения и изучения подобных объектов предназначены микроскопы различных типов. С помощью микроскопов определяют форму, размеры, строение и многие другие характеристики микрообъектов. Их фотографируют для дальнейшего изучения.

До середины ХХ века работали только с видимым оптическим излучением, в диапазоне 400-700 нм, а также с ближним ультрафиолетом (). Оптические микроскопы не могли давать разрешающей способности менее полупериода волны опорного излучения (диапазон длин волн 0,2—0,7 мкм, или 200—700 нм), потому максимальное увеличение, которого можно было добиться, составляло ~2000 крат. Т.е. способность различать структуры с расстоянием между точками до ~0,20 мкм. Но это было до 2006 года.

В 2006 году немецкие ученые Штефан Хелль (Stefan Hell) и Мариано Босси (Mariano Bossi) из Института биофизической химии разработали оптический микроскоп, позволяющий наблюдать объекты размером около 10 нм и получать высококачественные трехмерные изображения (см. в журнале ). Увидеть объекты размером менее 200 нанометров (минимальной длины волны ближнего ультрафиолетового излучения) было возможно только при помощи неоптических методов ( например, электронной микроскопии}, однако эти методы имели свои ограничения, в частности, в отличие от оптических не позволяли работать с целыми и тем более живыми клетками. Учёные применили метод микроскопии, в котором молекулы при помощи специально подобранного очень короткого импульса переводятся из «темного» состояния в «светлое», при котором они излучают энергию, люминесцируют. Излучаемый свет фиксируется и тем самым выдает данные об объектах размером значительно меньше 200 нанометров. Эта разработка позволила взглянуть в микромир живых клеток на атомно- молекулярном уровне в трехмерном пространстве 3D с разрешением изображений в 1-10 нм!

Флюоресцентный наноскоп (Наноскоп)

В основе наноскопии лежит впервые сформулированный новый метод российского ученого Андрея Климова, позволяющий увеличить разрешение оптических микроскопов на два порядка. Однако, патент, который оспаривается, принадлежит разработчикам и создателям Флюоресцентного наноскопа Штефану Хеллу (Stefan Hell) из Института биофизической химии (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry (Karl Friedrich Bonhoeffer Institute)) — 2006 год.

Метод Флюоресцентной наноскопии состоит в том, что покрашенные контрастируемыми флуоресцентными красителями образцы просматриваются с разрешениями в границах 1-10 нанометров — откуда и пошло «наноскопия».

Виды электронных микроскопов

Первоначальная вид электронного микроскопа. В просвечивающем электронном микроскопе используется высокоэнергетический электронный пучок для формирования изображения. Электронный пучок создается посредством катода (вольфрамового, LaB6, Шоттки или холодной полевой эмиссии). Полученный электронный пучок ускоряется обычно до +200 кэВ (используются различные напряжения от 20кэВ до 1мэВ), фокусируется системой электростатических линз, проходит через образец так, что часть его проходит рассеиваясь на образце, а часть — нет. Таким образом, прошедший через образец электронный пучок несет информацию о структуре образца. Далее пучок проходит через систему увеличивающих линз и формирует изображение на люминесцентном экране (как правило, из сульфида цинка), фото-пластинке или CCD-камере.

Разрешение ПЭМ лимитируется в основном сферической аберрацией. Некоторые современные ПЭМ имеют корректоры сферической аберрации.

Основными недостатками ПЭМ являются необходимость в очень тонком образце (порядка 100нм) и неустойчивость(разложение) образцов под пучком.ааааа

Просвечивающая растровая(сканирующая) электронная микроскопия (ПРЭМ)

Основная статья: Просвечивающий растровый электронный микроскоп

Один из типов просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), однако есть приборы работающие исключительно в режиме ПРЭМ. Пучок электронов пропускается через относительно тонкий образец, но, в отличие от обычной просвечивающей электронной микроскопии, электронный пучок фокусируется в точку, которая перемещается по образцу по растру.

Растровая (сканирующая) электронная микроскопия

В основе лежит телевизионный принцип развертки тонкого пучка электронов по поверхности образца.

Низковольтная электронная микроскопия

Применение методов (РМКС) для исследования кристаллов, структкр металлов и др. материалов, с величиной элементов с размерами, равными длинам волн рентгеноских лучей, используются в качестве опорного освещения кортковолновые лучи — рентгеновские лучи. Возможность применения рентгеновской оптики, которая используется в рентгеновских микроскопах, стала возможной благодаря ученому М. А. Кумакову, разработавшему первое рентгеновское зеркало. Именно благодаря этому, получена возможность преломлять рентгеновские лучи и разрабатывать рентгеновскую оптику. Рентгеновские лучи стали использовать вместо видимого света и электронных лучей. С момента «обуздания» Х-излучения положено начало новому направлению микроскопии рентгеновской микроскопии.

Новое направление в рентгеноскопии

Планарные параболические линзы

В настоящее время на основе оптических материалов кремния исследованы и созданы и , преломляющие Х-лучи. Это аналоги оптических устройств (тонких линз), используемых в диапазоне видимых лучей света. До последнего времени считались невозможными использовать преломляющие системы для рентгеновского излучения.

Получение изображений в реальном и фурье-пространствах

Рис.1,Применение планарных линз на примере прохождения Х-лучей в кристаллах

Фокусирующие элементы могут передавать рентгеновские изображения в реальном (видимом) пространстве объектов в виде стереоизображений 3D. В данном случае важно при создании методов , когда пространственное разрешение фиксируется предельным разрешением сфокусированного объекта на субмикронном атомно-молекулярном уровне. Эти методы уже с 1980 годов реализованы, но в диапазоне «мягких» Х-волн при использовании зонных пластинок Френеля и рентгеновской зеркалной оптикой. В данном случае, например, получают двумерные рентгеновские изображения при использовании мягких Х-лучей с энергией 1-1,5кэВ, где глубина поглощения менее 1мкм, что не на много больше разрешения, т.е. 20-100нм.

В диапазоне жёсткого излучения (мощностью от 6-10 до 100кэВ) работают преломляющие линзы c глубиной поглощения, достигающих величин больших значенийй разрешения самих линз.

С изобретением электронного микроскопа — 1930-е годы — начало создания современной науки об исследовании и изучении микромира под названием или микроскопия.

1960 г.

Thomas Everhart и Richard Thornley разработали улучшенный вариант детектора электронов, который и называется в их честь: Детектор Эверхарта-Торнли. Это самый распространённый детектор, используемый в сканирующих электронных микроскопах по сей день. Фактически, сам принцип остался неизменным с 1942 года. Новизна добавилась в детектировании упруго-отражённых электронов, где широко используются полупроводниковые датчики.

Что же такого предложили Everhart и Thornley? Схематично это выглядит так:

В вакуумной камере микроскопа рядом с образцом располагается клетка Фарадея 1. Внутри неё находится люминисцентный экран 3 (сцинтиллятор), излучающий фотоны при попадании электронов. Эти фотоны по световоду 2 выходят за пределы вакуумной камеры и попадают в ФЭУ, где на фотокатоде обратно преобразуются в электроны и многократно усиливаются за счёт эмиссии вторичных электронов на динодах внутри ФЭУ.

Чтобы не делать иммерсионную линзу, как Зворыкин, и не держать предметный столик под потенциалом 800 В, клетка Фарадея 1 выполняет функцию коллектора: на неё подаётся положительный потенциал около 200 — 400 В, который притягивает вторичные электроны с низкими энергиями, но практически не оказывает влияния на основной электронный луч.

Но электроны с энергиями порядка сотен эВ не приведут к возбуждению люминофора и излучению достаточного количества фотонов. Поэтому, на сцинтиллятор 3 (если он металлизирован, если нет, то придётся сделать вокруг него электростатическую линзу) подаётся ускоряющее напряжение порядка +12кВ, что гарантированно возбудит люминофор. Кстати, если бы не было клетки Фарадея 1, то это напряжение оказало бы значительное влияние на основной луч, сильно отклонив его.

Казалось бы, достаточно много лишних преобразований, но «просто это работает».
В начало статьи я вынес фотографию вакуумной части детектора Эверхарта-Торнли, где можно наглядно видеть клетку Фарадея, металлизированный сцинтиллятор, провода, подводящие ускоряющее напряжение и прочее.

А вот так фотоэлектронный умножитель видит

Изображение муравья в сканирующем электронном микроскопе

Ультраструктура неонатальных кардиомиоцитов после аноксии-реоксигенации

Просвечивающая электронная микроскопия

В просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ) для формирования изображения используется высокоэнергетический электронный пучок. Электронный пучок создается посредством катода (вольфрамового, LaB6, Шоттки или холодной полевой эмиссии). Полученный электронный пучок ускоряется обычно до 80—200 кэВ (используются различные напряжения от 20 кВ до 1 МВ), фокусируется системой магнитных линз (иногда электростатических линз), проходит через образец так, что часть электронов рассеивается на образце, а часть — нет. Таким образом, прошедший через образец электронный пучок несет информацию о структуре образца. Далее пучок проходит через систему увеличивающих линз и формирует изображение на люминесцентном экране (как правило, из сульфида цинка), фотопластинке или ПЗС-камере.

Основными недостатками ПЭМ являются необходимость в очень тонком образце (порядка 100 нм) и неустойчивость (разложение) образцов под пучком.

Просвечивающая растровая (сканирующая) электронная микроскопия (ПРЭМ)

Один из типов просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ); однако, есть приборы, работающие исключительно в режиме ПРЭМ. Пучок электронов пропускается через относительно тонкий образец, но, в отличие от обычной просвечивающей электронной микроскопии, электронный пучок фокусируется в точку, которая перемещается по образцу по растру.

В основе лежит телевизионный принцип развёртки тонкого пучка электронов по поверхности образца.

Раскрашенное изображение (PЭМ) фильтрующих щетинок антарктического криля

Некоторые типы детекторов, используемых в СЭМ, имеют аналитические возможности и могут обеспечить несколько элементов данных на каждом пикселе. Примерами являются детекторы, используемые в элементном анализе, и системы катодолюминесцентных микроскопов, которые анализируют интенсивность и спектр электронно-стимулированной люминесценции (например, в геологических образцах). В системах СЭМ использование этих детекторов является общим для цветового кода сигналов и накладывают их в единое цветное изображение, так что различия в распределении различных компонентов образца можно ясно видеть и сравнивать. Дополнительно, стандарт вторичных электронных изображений может быть объединен с одним или более композиционными каналами, так что можно сравнить структуру и состав образца. Такие изображения могут быть сделаны с сохранением полной целостности исходного сигнала, который не изменяется в любом случае.

Человеческий глаз представляет собой естественную оптическую систему, характеризующуюся определённым разрешением, т. е. наименьшим расстоянием между элементами наблюдаемого объекта (воспринимаемыми как точки или линии), при котором они ещё могут быть отличены один от другого. Для нормального глаза при удалении от объекта на т. н. расстояние наилучшего видения (D = 250 мм), среднестатистическое нормальное разрешения составляет 0,176 мм. Размеры микроорганизмов, большинства растительных и животных клеток, мелких кристаллов, деталей микроструктуры металлов и сплавов и т. п. значительно меньше этой величины. Для наблюдения и изучения подобных объектов и предназначены оптичские микроскопы различных типов.

Немецкие ученые Штефан Хелль в 2006 году и Мариано Босси из Института биофизической химии разработали микроскоп под названием Флюоресцентный наноскоп с разрешением в 1-10 нм и получать высококачественные трехмерные 3D изображения. Вся суть заклюсается в том, что здесь впервые применён принцип комбинированой микроскопии, когда опорное освещение по принципу лазерной рентгеноскопии позволяет получить оптическое изображение с выходными длинами волн оптического микроскопа, но обеспечивать разрешение микроскопии в диапазоне 1-10 нм.

История развития электронного микроскопа

В 1931 году Р. Руденберг получил патент на просвечивающий электронный микроскоп; в 1932 году М. Кнолль и Эрнст Руска построили первый прототип современного прибора. Эта работа Руски в 1986 году была отмечена Нобелевской премией по физике, которую присудили ему и изобретателям сканирующего зондового микроскопа Герду Карлу Биннигу и Генриху Рореру. Использование просвечивающего электронного микроскопа для научных исследований было начато в конце 1930-х годов, и тогда же появился первый коммерческий прибор, построенный фирмой Siemens.

В конце 1930-х — начале 1940-х годов появились первые растровые электронные микроскопы, формирующие изображение объекта при последовательном перемещении электронного зонда малого сечения по объекту. Массовое применение этих приборов в научных исследованиях началось в 1960-х годах, когда они достигли значительного технического совершенства.

Значительным скачком (в 1970-х годах) в развитии было использование вместо термоэмиссионных катодов — катодов Шоттки и катодов с холодной автоэмиссией, однако их применение требует значительно большего вакуума.

В конце 1990-х — начале 2000-х компьютеризация и использование ПЗС-детекторов значительно упростили получение изображений в цифровом виде.

В последнее десятилетие в современных передовых просвечивающих электронных микроскопах используются корректоры сферических и хроматических аберраций, вносящих основные искажения в получаемое изображение. Однако их применение может значительно усложнять использование прибора.

Микрофотография бактерий —

Существует несколько видов микроскопии: оптическая микроскопия, электронная микроскопия, рентгеновская микроскопия (рентгеновская лазерная микроскопия), отличающиеся конструктивными элементами, деталями, узлами самих микроскопов, что обеспечивает наблюдение в разных диапазонах спектра электромагнитных лучей.

Возможности микроскопии как метода изучения и фотографирования малых объектов зависят от разрешающей способности, применения новых технологий оптических систем, стереоскопии, методов подготовки объекта (срезы, окрашивание препаратов, использование метода тёмного- и светлого поля, поляризованного света и т.д.). Новые микроскопы расширяют возможности исследований в таких областях наук, как биологии, медицине, , минералогии, космосе и др.

Микроскопия в зависимости от микроскопов разделяется как:

vi:Kính hiển vi

История рентгеновской микроскопии

Идея просвечивающего электронного микроскопа состояла в замене опорного электромагнитного излучения на электронный пучок. Известно, что для увеличения разрешения микроскопов, использующих Электромагнитное излучение, необходимо уменьшение длины волны электромагнитного излучения до ультрафиолетового диапазон вплоть до рентгеновского (длина волны сопоставима с межатомными расстояниями в веществе) и основная трудность состоит в фокусировке ультрафиолетовых и, тем более, рентгеновских лучей. Последние вообще не поддаются фокусировке.

Возможности рентгеновской микроскопии

Голова мухи (фото сделано с помощью )

методов рентгеновской микроскопии практически достигает 100 нм, что в 2 раза выше, чем у оптических микроскопов (200нм). Теоретически рентгеновская микроскопия позволяет достичь на 2 порядка лучшего разрешения, чем оптическая (поскольку длина волны рентгеновского излучения меньше на 2 порядка). Однако современный оптический микроскоп — наноскоп имеет разрешение до 3-10 нм.

Проекционные рентгеновские микроскопы

Схема Рентгеновского микроскопа проекционного

Проекционные рентгеновские микроскопы представляют собой камеру, в противоположных концах которой располагаются источник излучения и регистрирующее устройство. Для получения чёткого изображения необходимо, чтобы угловая источника была как можно меньше.

Увеличение (М) в методе рентгеновской проекционной микроскопии определяется отношением расстояний от источника рентгеновского излучения до детектора (b) к расстоянию от источника до объекта (а):

М = b/a

В микроскопах такого типа до недавнего времени не использовались дополнительные оптические приборы. Основным способом получить максимальное увеличение является размещение объекта на минимально возможном расстоянии от источника рентгеновского излучения. Для этого фокус трубки располагается непосредственно на окне рентгеновской трубки либо на вершине иглы анода, помещенной вблизи окна трубки. В последнее время ведутся разработки микроскопов, использующих зонные пластинки Френеля для фокусировки изображения. Такие микроскопы имеют разрешающую способность до 30 нанометров.

Рис.2,Cхема флюоресцентного наноскопа с использованием Х-линзы, преломляющей Х-лучи

Электрон обладая свойствами не только частицы, но и волны, позволяет использовать, как опорное электронное излучение в микроскопии.

Длина волны электронного излучения зависит от его энергии, а энергия электрона равна E = Ve, где V — разность потенциалов, проходимая электроном, e — заряд электрона. Длины волн электронного излучения при прохождении разности потенциалов 200 000 В составляет порядка 0,1 нм. Электронное излучение легко фокусировать электромагнитными линзами, так как электрон — заряженная частица. Электронное изображение может быть легко переведено в видимое. Современные электронные микроскопы обеспечивают субатомное разрешение.