КОНТРАСТНЫЕ МЕТОДЫ В МИКРОСКОПАХ ПРОХОДЯЩЕГО СВЕТА

Артикул: Zeiss AxioVert A1

Микроскоп Zeiss AxioVert A1 – инвертированный микроскоп для сложных каждодневных исследований. Единственный в классе лабораторных систем микроскоп, поддерживающий все возможные методы контрастирования, в том числе дифференциально-интерференционный контраст (DIC). Долговечный источник света. Эргономичный тубус. Возможность подключения различных систем микроманипуляции.

«Свет — самое тёмное место в физике»

Объективы классифицируются по степени коррекции аберраций (оптических искажений) и линейному увеличению:

ПЛАН – в таких объективах исправлены сферические аберрации. Всё изображение резкое и четкое.

АХРОМАТ – в этих объективах исправлены хроматические аберрации для двух длин волн (красный и синий, либо красный и зелёный), то есть волны с этими длинами волн, сфокусированы в одной точке.

ФЛЮОРИТ (ФЛУОТАР, ФЛУОРИТ/ПОЛУАПОХРОМАТ) – в таких объективах скорректированы хроматические аберрации для нескольких длин волн. Так же такие объективы пропускают намного больше света, чем Ахроматы. Применяются для исследований в УФ спектре, поскольку используются специальные стекла с пропусканием в УФ области спектра.

АПОХРОМАТ – в таких объективах скорректированы аберрации для четырех и более длин волн. Обеспечивают превосходную цветопередачу и яркость изображения. Пропускают больше света из ИК и видимого спектра, чем Флюорит, но меньше УФ.

СУПЕРАПОХРОМАТ – самые сбалансированные объективы, отличаются наилучшей цветопередачей. Пропускают волны в видимом диапазоне, УФ и ИК.

Металлографический микроскоп – это световой микроскоп общего назначения, предназначенный для исследований непрозрачных объектов в отражённом свете (согласно ГОСТ 28489 90).

По конструкции подразделяется на прямой и инвертированный. Работая с инвертированным микроскопом не придётся делать шлиф двух поверхностей образца, потому что вся выровненная поверхность будет в поле зрения, будет находиться в одной плоскости резкости, без необходимости фокусироваться при смещении образца. Если микроскоп используется для исследований, а не рутинной работы, этих преимуществ недостаточно. Прямой металлографический микроскоп универсален и может быть оснащён: объективами с увеличением до 150х, модулями промежуточного увеличения 0,5х, 1х, 1,5х, 2х (общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения окуляров, всех промежуточных модулей увеличения и объективов), большинством методов контрастирования, доступным оптическим микроскопам. Прямой микроскоп отличается более низкой ценой, чем инвертированный микроскоп со схожим оснащением и большими возможностями по подбору комплектации под нужды исследователя.

Оснащённость металлографического микроскопа определяют объекты и методы исследования

Многие конфигурации микроскопов для анализа шлифа металлов оснащаются осветителем отражённого света, широкопольными окулярами, объективами 50 крат с большим рабочим расстоянием. Для того, чтобы исследователь мог более детально рассмотреть дефект, используют модули промежуточного увеличения, либо окуляры с кратностью более 10х. В вышесказанном есть неточность – детальность, при использовании дополнительных увеличивающих линз не повышается, так как она зависит от апертуры объектива, и каждая линза в оптической системе рассеивает часть проходящего света. Именно поэтому, рекомендуется использовать просветлённую оптику, с максимальной хроматической и план коррекцией, а если требуются детализированные изображения объектов меньше 100 мкм – устанавливать объективы с кратностью 100х и выше.

В металлографических микроскопах применяются различные виды освещения и контрастирования

При методе косого освещения возрастает роль дифрагированных волн, а значит оттеняется рельеф объекта (для этого рельеф должен быть ярко выражен). В прямых микроскопах косое освещение достигается установкой призмой косого освещения между объективом и окулярами, либо смещением, относительно оптической оси, апертурной диафрагмы. На небольших увеличениях можно использовать внешние источники мощного света, например, с помощью 30Вт светодиодного осветителя со световодами типа «гусиная шея» можно настроить косое освещение при использовании объективов с большим рабочим расстоянием (фактически, до 20х-50х крат). У есть более продвинутая гибридная технология – (направленное тёмное поле). При этой технологии, полый конус света подает на объект под углом, рассеивая свет даже на небольших изменениях рельефа.

Используя метод тёмного поля, пользователь видит рассеянный свет от образца, поэтому все неровности становятся светлыми на однородном тёмном фоне. Этот метод даёт негативное изображение к светлопольному и выявляет: трещины, царапины, зёрна, структурные отдельности, отчётливо просматриваемые границы зёрен, непротравленные границы и включения на поверхности.

Поляризованный свет выявляет анизотропные оптические структуры, преломляющие свет. Изотропные кристаллы буду поглощать свет при «положении скрещения» поляризатора и анализатора, а анизотропные (не имеющие кубической решётки) будут контрастны на фоне металла. Поэтому, вращая градуированный поворотный анализатор и сверяясь со специальными таблицами, можно идентифицировать неметаллические включения, определить размер и структуру зерна, по углу поворота анализатора.

Метод дифференциально-интерференционного контраста (ДИК). На данный момент — это самый совершенный метод контрастирования. Достигается такое контрастирование с помощью призмы Номарского: неполяризованный свет поляризуется, попадая в оптический путь микроскопа. Плоскость поляризации света наклонена на 49° к плоскому объекту. Проходя через призму Номарского, поляризованный свет разделяется на два пучка, со взаимно ортогональной плоскостью поляризации. Это дает максимально контрастное изображение, на котором отчётливо видны все неровности и границы – рельеф поверхности.

Помимо выбора оптики и методов контрастирования, специалисты должны обращать внимание на выбор источника света. Лучшим выбором будет светодиодный источник света, потому что такие осветители дают мощный поток света, не искажающий цветовосприятие (см. рисунок 5). Для коротковолнового освещения образца следует использовать разные светофильтры.

Наша компания предлагает для металлографии микроскопы

интересен набором модулей, таких как: (для регулировки высоты головки револьверов и осветителя), светодиодный осветитель ярче, чем 100Вт галогенная лампа, провставки для поляризации и ДИК и другими. – это прямые микроскопы, которые подойдут для рутинной работы, которые могут быть роботизированы, чтобы автоматически определять содержание окислов, кристаллов и других включений на поверхности шлифов.

Методы контрастирования в микроскопах отраженного света

Для лабораторных исследований в металлографии наиболее распростра­ненными являются три метода исследования и контрастирования:

— светлое поле;

— темное поле;

а в последнее время к ним добавились:

— дифференциально-интерференционный контраст (ДИК);

Все перечисленные методы исследования и контрастирования имеются и в микроскопах проходящего света, естественно, реализуются они в соответствии с особенностью оптической схемы микроскопии проходящего и отраженного света.

Метод темного поля. Этот метод является оптимальным для контроля поверхностей (рис. 3.6).

Основан на том, что реально имеющиеся структуры на поверхности за счет рельефа отклоняют свет в направлении объектива и становятся ярко видимыми на черном фоне. При работе по методу темного поля и полевая, и апертурная диафрагмы должны быть полностью открыты.

Рис. 3.6. Изображение при наблюдении в отраженном свете методом темного поля

Метод поляризации. Метод контрастирования, связанный с поляри­зацией света, оптимален для исследования поверхностей со структурами, изменяющими состояние поляризации света при отражении, напри­мер, анизотропные зерна в пробах руды, шлифах металлов и керамики (рис. 3.7).

Рис. 3.7. Изображение при наблюдении в отраженном свете методом поляризации

Особенностью микроскопа является наличие в оптической схеме поляфильтров: в осветительной части — поляризатора, а в промежутке между объективом и окуляром — анализатора. Наблюдение произво­дится тогда, когда оба поля фильтра развернуты друг относительно друга на 90°. При этом в поле наблюдается максимальное затемнение. Если объект обладает поляризующими свойствами, то на темном фоне появляется светлый или разноцветный объект с четким изображением по контуру. В микроскопе отраженного света поляризатор расположен в плоскости приближенной к коллектору и может быть выполнен враща­ющимся на угол 90°, в то же время анализатор устанавливается в блоке светоделительного элемента.

ДИК-метод. Метод дифференциально-интерференционного кон­траста является развитием метода поляризационной микроскопии. Он применяется для визуализации объектов с минимальными различиями по высоте неровностей на поверхности. Применение дифференциально­интерференционного контраста (ДИК) позволяет повысить контраст изображения и увеличить разрешающую способность микроскопа за счет получения «псевдостереоэффекта».

Основным оптическим компонентом, обеспечивающим этот способ наблюдения, является двоякопреломляющая призма Номарского. Она расположена между объективом и оптической системой микроскопа; находится на пути пучка света к образцу и расщепляет поляризованный пучок света на два частичных пучка (обыкновенный и необыкновен­ный). Если поверхность совершенно плоская, то ничего не происходит. Однако, если между двумя частичными пучками имеется небольшая ступень (перепад), то один из двух частичных лучей должен пройти путь на 2 ДЬ длиннее и приобретает разность хода. Проходя вторично через призму, отраженные лучи воссоединяются. После анализатора когерентные компоненты этих лучей, имеющие одинаковое направле­ние колебаний, интерферируют в промежуточном изображении. По­лучается двойное изображение объекта, однако, раздвоение настолько мало (близкое к пределу разрешения объектива), что его практически не видно, и объект воспринимается рельефным. Оптимальная картина дифференциального интерференционного контраста наблюдается при совмещении плоскости локализации интерференционных полос применяемой призмы с выходным зрачком, расположенным в задней фокальной плоскости используемых объективов. У большинства вы­пускаемых промышленностью объективов выходной зрачок находится внутри оптической системы на расстоянии 15 мм от опорной плоскости объектива.

В зависимости от плотности объекта, толщины или его показателя преломления, можно наблюдать цветным изображение самого объекта или четкий цветной контур вокруг него. Как мы уже отмечали, в обычных микроскопах рельефность или стереоскопичность возникает в пределах глубины резкости объектива. В данном случае это значительно усилива­ется за счет цветового эффекта.

Метод может быть реализован в проходящем и отраженном свете. В современных зарубежных микроскопах метод ДИК широко при­меняется в микроскопах всех типов, начиная с лабораторного класса (рис. 3.25).

Рис. 3.25. Изображение при наблюдении методом ДИК:

А — проходящий свет;

Б – отраженный свет

В отличие от микроскопов отраженного света для реализации метод ДИК в проходящем свете требуется применение двух призм Волостона: одна устанавливается в конденсоре вместе с поляризатором, вторая, как и в отраженном свете, располагается за объективом. Далее по ходу лучей устанавливается анализатор. Механизм действия аналогичен отраженному свету.

Для осуществления метода ДИК необходимо иметь специально рассчитанные призмы под каждый объектив или на 2-3 объектива различного увеличения и типа оптической коррекции, но с близким положением задней фокальной плоскости объектива. Разность хода, возникающая на поверхности, преобразуется в значения серого, которыйвоспринимаются глазом: ступени становятся видимыми в виде рельефа. Как вспомогательный элемент, λ-пластина преобразует значения серого в цвета. Движение призмы перпендикулярно оптической оси микроскопа создает условие для получения различных цветовых однородных окрасок поля видения.

Для получения более ясной картины, связанной с действием поля­ризованного света, предметный столик, на котором находится объект, поворачивают или вращают. Новая разработка фирмы CarlZeissпозволяет упростить процесс наблюдения, предлагая поворачивать анали­затор. Новый метод получил название C-DIC(метод ДИК с круговой поляризацией).

Для зарубежных микроскопов, в частности фирмы «Карл Цейсс», призма рассчитывается и технологически выполняется таким образом, что при установке ее в рабочее место на микроскопе цвет фона и оконтуривания уже подобраны.

Поиск на сайте:

Методики контрастирования при работе с микроскопом

При работе с микроскопом исследователи часто сталкиваются с низким контрастом изображения в окулярах и на фотокамере. Иногда крайне затруднительно различить мельчайшие дефекты на кремниевой пластине или определить рельеф поверхности образца. Причин может быть несколько, но в основном это несоответствие условий освещения задачам наблюдения. В этой статье речь пойдет о повышении информативности изображения при использовании специальных фильтров и оптических компонентов, меняющих природу формирования изображения. Мы рассмотрим методики контрастирования на микроскопах отраженного и проходящего света, подробно отразив схемы хода лучей.

Фазовый контраст

Фазовый контраст используется в основном в биологии для изучения живых неокрашенных клеток. Метод основывается на разности оптической плотности (показателя преломления) разных частей наблюдаемого объекта, а также среды, в которую образец заключен. Например, упрощенно рассматривая клетку, расположенную в водном растворе, мы сможем выделить три зоны: А (водный раствор), В (цитоплазма) и С (ядро).

Метод фазового контраста в проходящем свете.1 — фазовая вставка в конденсор, 2 — линза конденсора, 3 — образец, 4 — объектив, 5 — фазовое кольцо в объективе, 6 — лучи со сдвигом фазы, 7 — луч без запаздывания

Световые волны незначительно смещаются, проходя через различные среды, из-за разности показателя преломления. Причем, помимо геометрического смещения, происходит явление запаздывания — смещение фазы. До прохождения через препарат волны света находятся «в фазе», а после прохождения через различные материалы — уже нет. Величина фазового смещения будет зависеть от оптической плотности материалов, а также от величины пути в этих средах. Наш глаз не может заметить разность фаз в изображении. Он различает только разницу интенсивности и разницу цвета. Метод фазового контраста позволяет преобразовать значения фазового сдвига в значения интенсивностей света.

В конденсор микроскопа вставляется специальная фазовая вставка (кольцевая диафрагма, схожая с темнопольной вставкой). Свет, прошедший через нее, формируется конденсором и освещает препарат. Весь пучок света поступает в объектив и в зрачке объектива формируется изображение фазовой вставки. В этом месте в объективе расположено нанесенное на стекло фазовое кольцо — оптический материал, снижающий интенсивность излучения и придающий свету постоянное фазовое смещение. Если в препарате содержатся объекты, изменяющие направление луча (как клетки и их ядра), то свет из прямого луча отклоняется на новую траекторию. Этот свет не проходит сквозь фазовое кольцо, не ослабляется и не задерживается. Все частичные лучи объединяются тубусной линзой и формируют промежуточное изображение.  В нем частичные лучи, поступающие с различными фазами, ослабляются или усиливаются, накладываясь друг на друга. Таким образом, разность фаз превращается в разницу интенсивностей, которую может регистрировать наш глаз.

Метод фазового контраста незаменим при работе с живыми клетками, проведении ЭКО, различных манипуляциях с неокрашенными препаратами.

При изучении неокрашенных объектов, которые отличаются от окружающей среды только показателем преломления, интенсивность света не меняется. Меняется лишь фаза световых волн. Такие изменения абсолютно незаметны в светлом поле, поскольку микроорганизмы прозрачны и не имеют цвета.

Для исследования таких объектов подходит именно фазово-контрастная микроскопия. Её суть — трансформация фазовых изменений световой волны в амплитудные, видимые глазу.

Рис. 3 Фазовые пластинки

Оборудование для фазового контраста можно установить на любой световой микроскоп. Оно состоит из:

Рис. 4 Устройство фазового контраста

Настройка включает следующие этапы:

После этого вспомогательный телескоп необходимо настроить с помощью винтов регулировки. Затем телескоп снова заменить окуляром.

Применение этого метода позволяет добиться увеличения контрастности живых неокрашенных микроорганизмов на светлом или тёмном фоне. Таким способом исследуют клетки, вирусы, минеральные и органические компоненты.

Рис. 5. Клетка в фазовом контрасте

Поляризация

Поляризация – широко применяющийся метод контрастирования, меняющий физику изображения. Этот метод позволяет убрать блики поверхностей с высоким коэффициентом отражения, получить качественное и насыщенное изображение, но главное – с поляризацией возможно проведение петрографических исследований и измерений углов поляризации для определения состава объекта. Для проведения поляризационных исследований необходимо два компонента – поляризатор (обычно неподвижный) и анализатор (обычно вращаемый). Два фильтра (поляризатор и анализатор), введенные последовательно в ход лучей и повернутые относительно друг друга на 90 градусов, не пропускают свет. Первый фильтр изменяет плоскость поляризации света таким образом, что пропущенный им свет не может пройти через второй фильтр (анализатор). Реализация поляризованного освещения в микроскопе достаточно простая задача. При работе с проходящим светом поляризатор устанавливается в конденсор, а анализатор находится за объективом. В отраженном свете анализатор остается на своем месте, а поляризатор устанавливается перед дихроичным зеркалом сразу после апертурной диафрагмы осветителя отраженного света. В обоих случаях образец освещается плоскополяризованным светом. Если образец при освещении поворачивает направление колебаний поляризованного света из плоскости заданной поляризатором, то в окулярах мы начинаем видеть свет, который частично пропускает анализатор. Явление поляризации характерно прежде всего для таких кристаллов как минералы, а также для полимеров.

Поляризация в отраженном свете.1 — осветитель, 2 — поляризатор, 3 — дихроичное зеркало, 4 — объектив, 5 — образец, 6а — лямбда-пластина, 6 — анализатор, 7 — тубусная линза

Поляризация в проходящем свете.1. поляризатор, 2 — конденсор, 3 — образец, 4 — объектив, 5а — лямбда пластина, 5 — анализатор, 6 — тубусная линза

Обычно в оптический путь перед анализатором вводят компенсатор «Лямбда-пластину» (иногда его называют красной пластиной первого порядка). Линейно поляризованный луч в кристалле компенсатора раскладывается на 2 луча: обыкновенный и необыкновенный, близкие по интенсивности. При выходе из компенсатора необыкновенный луч получает запаздывание на одну длину волны относительно обыкновенного. Но поскольку обыкновенный и необыкновенный лучи поляризованы по-разному, то интерферировать они не могут. Пройдя анализатор, установленный перпендикулярно поляризатору, оба луча будут ослаблены наполовину, но их плоскости поляризации теперь совпадут. Лучи интерферируют, и, в результате, поле зрения окрашивается в розово-красный цвет (как правило разность хода волн в компенсаторе порядка 580 нм). Если между поляризатором и компенсатором окажутся оптически-активные включения, то для прошедших через них лучей условия интерференции будут другими, и изменится их цвет. То есть компенсатор осуществляет цветовое контрастирование оптически-активных объектов. Углом поворота компенсатора можно в определенной мере менять цвет фона и «раскраску» объектов, но при угле 45 градусов относительно поляризатора и анализатора будет получена максимальная интенсивность.

Механические напряжения в стекле приводят к двулучепреломлению, оказывающему воздействие на поляризованный свет. Часто для проведения количественных поляризационных исследований используют специальные объективы, не обладающие внутренними напряжениеями, они имеют маркировку Pol.

Хоффмановский контраст

Хоффмановский контраст (ХК) — это метод косого освещения, при котором за счёт градиентности оптических фаз повышается контраст в окрашенных и неокрашенных препаратах. С его помощью можно получать трёхмерное высокоточное изображение живых образцов, что открывает большие возможности для различных научных и медицинских исследований. Большое рабочее расстояние с применением высоких числовых апертур обеспечивает точное отслеживание движения объектов.

Другие виды исследований (электрофизиология, ЭКО) требуют использования не только конденсоров, но и объективов с большим рабочим расстоянием. Хоффмановский контраст позволяет проводить послойное изучение толстых образцов, выбирая последовательность фокальных планов.

Метод может применяться на микроскопах с флуоресцентными осветителями. Исследование морфологии с применением флуоресценции или без возможно без замены образца и объективов. По сравнению с фазовым контрастом, при Хоффмановском контрасте не возникает эффект Гало — вторичное свечение по контуру изображения, мешающее получать полную информацию об объекте.

Рис. 9 Биологическое оборудование для исследования прозрачных объектов

Дифференциально-интерференционный контраст

Дифференциально-интерференционный контраст (ДИК) — это усовершенствованный (в сравнении с поляризационным) метод получения контраста в прозрачных образцах. Для этого исследования используют микроскоп с лучепреломляющей призмой Номарского. Она расщепляет поляризованный луч на два световых пучка, которые проходят через образец оптическими путями разной длины.

Рис. 11 Виды поляризации. Поляризация описывается фигурами Лиссажу и соответствует сложению поперечных колебаний равной частоты

Применение этого метода позволяет получать монохромное изображение, отображающее градиент высокопространственных и низкопространственных частот, содержащихся в образце. Участки образца, в которых длина оптических путей возрастает по отношению к контрольному пучку, становятся ярче или более тёмными. Участки с меньшими различиями демонстрируют обратный контраст. Чем выше градиент оптических пучков, тем более контрастным получается изображение.

Рис. 12 Схема ДИК микроскопии в проходящем свете

Документы для

Закажите лабораторное оборудование указав контактные данные и мы с вами свяжемся в ближайшее время.

Поляризационный контраст

Поляризация применяется для исследования анизотропных объектов, обладающих двойным лучепреломлением или отражением. Это могут быть минералы, угли, кристаллы, шлаки, ткани и клетки, волокна.

Рис. 6: А — источник света. В – неполяризованный свет. С – поляризационная решётка. D –поляризованный свет

Суть метода — наблюдение образцов в свете, созданном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях. Для этого в стандартный микроскоп устанавливают два дополнительных фильтра — поляризатор и анализатор, которые расположены параллельно друг к другу. Поэтому при исследовании в тёмном поле зрения прибора можно наблюдать тёмные, светлые либо окрашенные анизотропные элементы. Их вид зависит от положения объекта относительно плоскости поляризации. Повысить точность получаемых оптических данных можно при помощи компенсаторов — клиньев и пластинок.

Рис. 7 Двойное лучепреломление

Рис. 8 Оптическая ось кристалла

Темное поле/косопадающий свет

При освещении объекта коаксиальным светом через объектив очень сложно оценить топографию поверхности объекта или микродефекты образца из-за отсутствия теневых областей. Иногда бестеневое освещение необходимо (в случае реставрационных работ под стереомикроскопом или при проведении каких-либо хирургических операций), но в случае, когда нам необходимо определить рельеф поверхности, тени – единственное, за что сможет зацепиться наше зрение. Для того, чтобы создать рельефную контрастную картину, необходимо осветить объект сбоку так называемым косопадающим светом. На стереомикроскопе при помощи специальных осветителей типа «гусиная шея» сделать это не составит труда, в то время как на лабораторном микроскопе крошечное рабочее расстояние объектива не позволит вводить источник света сбоку. На помощь в таком случае нам придут темнопольные объективы (индекс BD – Brightfield/Darkfield).

Темное поле в отраженном свете.1 — осветитель отраженного света, 2 — система конических зеркал, 3 — наклонное кольцевое зеркало, 4 — темнопольный объектив, 5 — образец на предметном столе

Такие объективы обладают дополнительным металлическим цилиндром снаружи, являющимся проводником и отражателем света. Свет не попадает через объектив непосредственно в поле зрения, но попадает через полый цилиндр на поверхность образца вне поля зрения, и, отражаясь от нее, обеспечивает предельно косопадающее освещение видимой области. Микрочастицы, расположенные на ровной поверхности образца, начинают светиться, трещины и прочие дефекты резко подчеркивают грани. При работе в проходящем свете достаточно воспользоваться темнопольной вставкой в конденсор — метод А. При работе с объективами с высокой числовой апертурой необходимо использовать диафрагму, отрезающую проходящий свет из конденсора — метод B.

Темное поле в проходящем свете. ( Метод А: темнопольная вставка в конденсоре)1 — вставка в конденсор, 2 — конденсорная линза, 3 — образец, 4 — объектив

Темное поле в проходящем свете. ( Метод В: апертурная диафрагма объектива с высокой NA, отрезающая проходящий свет)1 — темнопольная вставка в конденсор, 2 — конденсорная линза, 3 — образец, 4 — объектив, 5 — апертурная диафрагма

Дифференциально-интерференционный контраст Номарского (DIC, ДИК)

Дифференциально-интерференционный метод контрастирования (DIC) является, в некотором виде, комбинацией методов фазового и поляризационного контраста. В проходящем свете дифференциально-интерференционный контраст реализуется несколько сложнее из-за использования двух ДИК-призм (двулучепреломляющие призмы). Ход лучей при ДИК контрастировании схож с поляризационным методом, но дополнительно в оптический путь вводятся две ДИК-призмы — в конденсор и вблизи зрачка объектива. Призма в конденсоре осуществляет векторное разложение плоскополяризованного света по двум взаимноперпендикулярным направлениям колебаний и смещает их в боковом направлении так, что в препарате возникает боковое смещение составляющее дельта Х = к * лямбда. К — коэффициент смещения, обычно меньше единицы.

Дифференциально-интерференционный контраст (ДИК контраст) в отраженном свете.1 — осветитель, 2 — поляризатор, 3 — дихроичное зеркало, 4 — ДИК призма, 5 — объектив, 6 — образец, 7а — лямбда-пластина, 7 — анализатор

Дифференциально-интерференционный контраст (ДИК контраст) в проходящем свете.1 — поляризатор, 2 — ДИК призма, 3 — конденсор, 4 — образец, 5 — объектив, 6 — ДИК призма объектива, 7а — лямбда пластина, 7 — анализатор, 8 — тубусная линза

Далее вспомним метод фазового контраста. Если оба частичных луча пройдут через совершенно одинаковые структуры, то они не приобретут разность хода. Но если для частичных пучков имеются различные условия (разная оптическая плотность образца), то каждый из них на выходе из образца приобретает свою разность хода. Частичные пучки собираются второй ДИК призмой, анализатор выбирает из смещенных по фазе волновых комплектов только те, которые колеблются в направлении анализатора. Таким образом, после анализатора мы получаем лучи, колеблющиеся в одном направлении и разные по фазе. Накладываясь друг на друга, лучи интерферируются и, таким образом, фазовый сдвиг превращается в разность интенсивности. Посредством лямбда-пластины достигается дополнительный цветовой контраст. Метод показывает только «продольные» изменения, следствием чего является получение рельефных изображений. Д ИК в проходящем свете превосходно подходит для отображения отдельных сечений неокрашенных толстых объектов.

Метод тёмного поля

Суть темнопольной микроскопии заключается в способности некоторых микроорганизмов к интенсивному рассеиванию света. Метод подходит для получения изображений живых и неокрашенных образцов, например, одноклеточных водных организмов.

Для исследования используются стандартные объективы и особые темнопольные конденсоры. Особенность вторых в том, что их центральная область затемнена. Что исключает попадание в объектив микроскопа прямых лучей осветителя. На образец направлены только боковые лучи, за счёт чего в объективе можно наблюдать только лучи, рассеянные исследуемыми частицами. Метод базируется на эффекте Тиндаля, пример которого — видимость частиц пыли в воздухе при освещении конусообразным солнечным лучом.

Во избежание попадания в объектив прямых лучей осветителя, действующее отверстие объектива (апертура) должно быть меньшего диаметра, чем у конденсора. Для его уменьшения внутрь стандартного объектива устанавливают диафрагму либо применяют специальные оптические приборы с ирисовой диафрагмой.

Применение метода тёмного поля позволяет добиться яркого свечения микроорганизмов на чёрном фоне, за счёт чего можно обнаружить даже самые мельчайшие частицы, чьи размеры выходят за пределы разрешающей способности микроскопа. Но в этом случае можно наблюдать лишь контуры объектов, без возможности изучения их внутренней структуры.

Для изучения препаратов необходимы предметные стёкла толщиной не более 1,2 мм, не имеющие загрязнений или повреждений. Также следует не допускать наличия в образце пузырьков воздуха, крупных частиц. Необходим мощный осветитель, с максимальным накалом лампы. Настройка осуществляется в несколько этапов:

После этих этапов необходимо установить объектив нужного увеличения и приступать к исследованию образца.

Рис. 2 Освещение препарата в методе темного поля в отражённом свете

Флуоресценция (люминесценция)

Некоторые невидимые при обычном свете вещества обладают способностью к люминесценции, то есть могут светиться, поглощая энергию источника. Именно на этом основана флуоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Поглощая фотоны света, образец излучает свет другой, более длинной волны фотолюминесценции (правило Стокса).

Люминесценцию провоцируют при помощи ультрафиолетового излучения либо специальных красителей. Исследование проводится с помощью специального флуоресцентного микроскопа. Его особенности:

Для проявления люминесценции образцы освещают через объектив. Важную роль здесь выполняет специальная интерференционная светоделительная пластинка. Это полупрозрачное стекло, которое выборочно отражает и направляет в объектив долю спектра, провоцирующего люминесценцию, пропуская её свет в окуляр.
Оптическую систему флуоресцентного микроскопа изготавливают из специальных сортов оптического стекла, не подверженных люминесценции, склеивая их нелюминесцирующим клеем.

У большей части исследуемых частиц отсутствует собственная люминесценция, поэтому для наблюдения за ними применяются специальные способы обработки. Например, флуорохромирование — окрашивание частиц сильно разбавленными флуоресцирующими красителями.

В сравнении с обычной, флуоресцентная микроскопия открывает более широкие возможности для изучения различных клеток, их микроструктуры, функциональных и морфологических изменений.

Рис. 10 Флуоресцентный микроскоп — оптический прибор, показывающий в увеличенном виде клетки

Carl Zeiss AxioVert A1 – исследовательский инвертированный микроскоп

Carl Zeiss AxioVert A1 имеет преимущества перед другими исследовательскими микроскопами:

Микроскоп Zeiss AxioVert A1 – использование всех возможных методов контрастирования

Удобство уже заложено в конструкцию Axio Vert A1: вне зависимости от того, сидите вы или стоите, вы можете использовать специальные подставки, чтобы работать в вертикальном положении. Эргономичный тубус позволит наклонять окуляры под нужным углом. Вы всегда можете с лёгкостью визуализировать ваши образцы. Эргономичность всех рабочих компонентов существенно упростит рутинные задачи — особенно, когда нужны оперативные исследования.

Мультиконтрастная система для ЭКО

Микроскоп объединяет в себе контраст Хоффмана, DIC и PlasDIC и позволяет легко переключаться между ними без дополнительных действий. Такие методы наиболее востребованы в ЭКО-лабораториях. Также в конструкции предусмотрено достаточно места для микроманипуляторов. Вы можете надежно закрепить классическую систему микроманипуляции к колонне проходящего света. Низкий уровень вибрации позволит регулировать движения с высочайшей точностью.

Если вы изучаете эмбрионы или ядра клеток, контраст Хоффмана позволит чётко увидеть форму ядра и ядрышки. Контраст PlasDIC обеспечит качественную визуализацию таких структур, как прозрачная оболочка ооцитов. Благодаря эффекту рельефа вы сможете точно определить место введения. Дифференциально-интерференционный контраст обеспечит получение изображений в высоком разрешении даже при сильном увеличении. Вы можете проводить быстрый анализ формы вакуолей, а также оценку количества сперматозоидов.

Подключите камеру

Подключите к микроскопу цифровую камеру, например, ADF Ultra09. Получайте высококачественные изображения, проводите измерения, экспортируйте результаты измерений в электронную таблицу.

Объективы

Маркировка объективов Olympus:

Термины

Числовая апертура – это безразмерная величина, которая характеризует диапазон углов, в которых оптическая система может принимать или испускать свет. В микроскопии от числовой апертуры напрямую зависит и разрешение.

Разрешение – это минимальное различимое расстояние между двумя соседними точками.

Поле зрения – диаметр видимого изображения на исследуемом объекте.

Иммерсия – специальная жидкость с определённым коэффициентом преломления, служащая средой для прохождения света между исследуемым объектом и объективом для увеличения апертуры.

Рабочее расстояние – расстояние от линзы до исследуемого объекта, в пределах которого его изображение будет резким.

Оптическая система с коррекцией на бесконечность – свет, собранный от образца, проходит через линзы объектива параллельными лучами. Параллельные лучи преломляются в линзах тубуса и фокусируется в промежуточное изображение.

Такая корректировка даёт неоспоримые преимущества: можно изменять расстояние между тубусом и объективом, добавлять модули для ортоскопии, коноскопии, дополнительные светоделители и прочие.

Поляризационный объектив (P) – объектив, изготовленный из специального стекла без внутренних напряжений.

Объектив для фазового контраста (PH) – объектив со встроенным фазовым кольцом.

Объективы Olympus подразделяются на сферы использования: для естественных наук и материаловедения. Виды объективов:

UPLSAPO – Универсальные План Суперапохромат, объективы с максимально возможной коррекцией в видимой части спектра, ближнем УФ и ИК. Имеется регулировка рабочего расстояния и апертуры. Такие объективы используются в конфокальных микроскопах и оптических системах сверхвысокого разрешения. Забудьте «мыльное» изображение в школьных микроскопах, в эти объективы вы сможете рассмотреть даже органеллы клеток, но для этого класса оборудования, такая задача не ставится. Такие объективы предназначены для конфокальных микроскопов, слайд-сканнеров и инспекционных систем. Обратите внимание на график светопропускания. Многие ошибочно думают, что пропускание такого широкого спектра лучей – невозможно, но факты говорят сами за себя.

PLAPON – План Апохромат, объективы с коррекцией в видимом диапазоне, ближнем УФ и частично ИК. Хорошее решение для спектрометрии и исследований в ИК диапазоне.

UPLFLN – Универсальные План Флюорит, объективы с коррекцией в видимом диапазоне и УФ. Предпочтителен при недостатке освещения, т.к. пропускает больше всего света. Лучшие друзья биологов, медиков и криминалистов. Слабая флуоресценция – серьёзная проблема для естественных наук, а учитывая, что каждая линза, даже просветлённая, рассеивает 2-5% света. В системе из 8 линз недостаток чувствуется очень остро. В этих объективах используется специальное низкодисперсное (UD) стекло и минерал флюорит, которое пропускает максимально возможное количество света. Изображение в этих объективах выглядит максимально сочным, ярким и резким, потому что в нём скорректированы практически все хроматические аберрации. У флюоритов низкий уровень дисперсии, поэтому расхождение света минимально и пользователь не видит цветного гало, даже на максимальном приближении.

PLN – План Ахромат, объективы с коррекцией в видимом диапазоне (голубой, зелёный, жёлтый). Эти объективы – стандарт для любой клинико-диагностической лаборатории. Хорошо пропускают свет во всём видимом спектре, а План коррекция позволяет работать со всем полем зрения без дополнительной перефокусировки.

ACHN – Ахромат, объективы без коррекции сферических аберраций, но с частичной коррекцией хроматизмов. Эти недорогие объективы подойдут для образовательных учреждений и любителей.

LCACHN – Ахромат с большим рабочим расстоянием, недорогие объективы предназначенные для исследования объектов с выраженным неровным профилем.

CPLFLN – План Флюорит для прецентрированного фазового контраста. Прецентрированный фазовый контраст, это одно из чудес современной оптики, ведь его нельзя сбить и не нужно каждый раз тратить время на точную настройку. У этих объективов большое рабочее расстояние, поэтому их используют в инвертированных микроскопов для микроскопии культур в специальной посуде.

APO – Апохромат, скорректированы многие хроматические аберрации в видимом, ближнем УФ и ИК диапазоне. Передаёт истинные цвета изображения и может использоваться для цитологии и гистологии.

UPLFL-P – План Флюорит для поляризации, сочетает в себе все достоинства флюорита и свободного от внутренних напряжений стекла. Универсальный светосильный объектив, в сочетании с линзой Бертрана отлично подходит для поляризации и ДИК. Эти объективы используют кристаллографы и минерологи, криминалисты, исследователи различных волокон. Поляризация один из основных методов контрастирования, ведь она не требует предварительной подготовки образцов, поэтому данные объективы широко распространены.

XLFLUOR – Флюорит для флуоресцентных исследований на малых увеличениях. Объектив уникален как по позиционированию, так и по исполнению. Обнаружить флуоресценцию в крупных объектах гораздо сложнее, чем рассмотреть её на большом увеличении. Всё дело в засветке и крайне малой светимости для малого увеличения, но у этого объектива малое поле зрения, максимально возможная (для малого увеличения) апертура, а значит высокая чувствительность.

MPLAPO – План Ахромат для материаловедения. Рассчитан на работу в отражённом свете, то есть свет падает через объектив на образец и отразившись от образца проходит через объектив и попадает на окуляры. Блики от осветителя отражённого света отсутствуют. Эти объективы устанавливаются в металлографических микроскопах, микроскопах для исследований нано материалов и мельчайших структур. В первую очередь – это исследовательские объективы.

MPLFLN – План Флюорит для материаловедения. Хорошая просветлённая оптика отлично подойдёт для изучения материалов, а ультрафиолете, а также ДИК контрасте.

MPLFLN-BD – План Флюорит для материаловедения, для светлого и тёмного поля. Свет в этом объективе попадает от осветителя на образец, через специальные каналы в стенках объектива, благодаря чему, реализуется метод тёмного поля.

MPLFLN-DBP — План Флюорит для материаловедения, для светлого, тёмного поля и поляризации. Отличается от предыдущего оптикой без напряжений. Лучшее, из доступного на данный момент, в среднем ценовом сегменте профессиональных микроскопов.

LMPLFLN – План Флюорит для материаловедения с большим рабочим расстоянием. Сделать объектив с большим рабочим расстоянием – весьма нетривиальная задача, потому что длиннофокусные линзы дают менее чёткое изображение.

MPLN – План Ахромат для материаловедения. Рядовые объективы, которые отлично подойдут для несложных исследований в металлографии, химии и электронике.

MPlanIR – Объективы для ИК микроскопии. Переключение между ИК и видимым освещением требует от обычного объектива фокусировку и подстройку освещения. С ИК коррекцией этого делать не нужно. Это не только экономия времени, но и повышенная точность.

Метод светлого поля

Этот метод подходит для исследования прозрачных препаратов, которые содержат непрозрачные объекты, либо в них присутствуют структурные участки с разным коэффициентом преломления. Например, тонкие срезы биотканей или окрашенные шлифы минералов.

Световой пучок, образованный осветителем микроскопа, проходит сквозь образец препарата и объектив. В плоскости изображения образуется равномерно освещённое поле. Непрозрачные частицы, содержащиеся в препарате, отражают либо частично поглощают свет, образуя лучи разного уровня интенсивности. Это способствует проявлению изображения.

Метод также используется при изучении непоглощающих объектов. Но только тех, которые способны рассеивать пучок света так, чтобы основная его часть оставалась за пределами объектива.

Рис. 1 Принцип освещения по Кѐллеру. 1 – источник света, 1а – изображение источника света, 2 – коллектор, 3 – полевая диафрагма осветителя, 3а – изображение полевой диафрагмы, 4 – светофильтр, 5 – апертурная диафрагма, 6 – конденсор, 7 – препарат, 8 – объектив микроскопа