в
микробиологии: устройство микроскопа
и основные приемы микроскопирования
живых микроорганизмов
1 Особенности
разных видов микроскопии
2 Устройство
светлопольного микроскопа
3 Правила работы
с иммерсионным объективом
4 Приемы
микроскопирования живых микроорганизмов
Разрешающую
способность микроскопа можно несколько
повысить,используя объектив с иммерсией. В
этом случае пространство между покровным
стеклом и фронтальной линзой объектива
заполняется средой с показателем
преломления близким к показателю
преломления покровного стекла. Объективы
с иммерсией называют иммерсионными,а
без неё-сухими. Хорошей иммерсионной
средой является кедровое масло. Показатель
преломления кедрового масла практически
совпадает со значением показателя
преломления стекла. Иммерсия увеличивает
угол раскрытия,а значит и разрешающую
способность микроскопа A=n*Sin(u/2). Обычно
произведение показателя преломления
на синус аппертурного угла называют
числовой апертурой.
Метод основан на способности некоторых веществ избирательно поглощать ультрафиолетовые лучи с определенной длиной волны, принципиально почти ничем не отличается от обычной световой микроскопии и осуществляется при помощи микроскопов с кварцевой или отражательной (зеркальной) оптикой. Изображение рассматривается на флюоресцирующем экране визуально, а также фотографируется. Микроскопирование объектов позволяет выявить исследуемые вещества, не применяя окрашивания.
Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия позволяет изучать как собственную (первичную) флюоресценцию ряда веществ, так и вторичную флюоресценцию, вызванную окрашиванием клеточных структур специальными красителями — флюорохромами. Принцип метода состоит в том, что некоторые вещества при световом облучении начинают светиться сами.
Для возбуждения флюоресценции в видимой части спектра обычно пользуются синим светом или ультрафиолетовыми лучами. Многие вещества, не флюоресцирующие в видимой области (в особенности нуклеиновые кислоты), при освещении ультрафиолетовыми лучами начинают флюоресцировать и могут выявляться без применения флюорохромов (рис. 1.30).
Рис. 1.30. Процесс митоза (флюоресцентная микроскопия)
Ультрафиолетовая
и люминесцентная микроскопия проводится
на специальных ультрафиолетовых
микроскопах, конструктивно схожих с
соответствующими приборами для видимого
света. В этих микроскопах применяется
оптика из кварцевого стекла, прозрачного
для ультрафиолетовых лучей в области
220-400 нм. В качестве источников света
используется ртутная лампа высокого
давления.
Помимо
специальных приборов, в области 360-400
нм, ограниченной пропусканием стеклянной
оптики, можно работать на любых световых
микроскопах, если использовать в качестве
источников света осветитель с галогеновой
лампой и набором светофильтров.
Исследование
микропроб живописи на ультрафиолетовых
микроскопах проводят обычно в свете
видимой люминесценции либо в отраженных
ультрафиолетовых лучах на шлифах.
На
некоторых современных приборах невидимое
ультрафиолетовое изображение преобразуется
в видимое с помощью флуоресцентных
экранов или электронно-оптических
преобразователей, и тогда в отраженных
ультрафиолетовых лучах можно работать
как на обычных световых микроскопах.
Если указанные преобразователи
отсутствуют, изображение регистрируют
фотографически.
Если
поместить компоненты микропробы в
постоянный или временый иммерсионный
препарат, используя для этого кварцевое
стекло и нелюминесцируюшие прозрачные
в ультрафиолетовой области иммерсионные
жидкости, то можно проводить микроскопическое
исследование в проходящем ультрафиолетовом
свете при больших увеличениях 200-600x по
методу светлого или темного поля.
По
сравнению с обычной ультрафиолетовая
микроскопия имеет ряд важных преимуществ
при исследовании микропроб живописи,
которые особенно наглядны при
стратиграфическом анализе шлифов: в
ультрафиолетовой области возрастает
разрешающая способность микроскопа,
многие бесцветные (не поглощающие в
видимой области) компоненты живописи,
трудно различимые в обычном микроскопе,
обладают «ультрафиолетовой окраской».
Кроме того, многие минеральные и
органические пигменты, имеют в
ультрафиолетовой области более
интенсивные, чем в видимой, максимумы
поглощения. Спектры поглощения в
ультрафиолетовой области многих желтых
и бесцветных материалов живописи очень
круто спадают в сторону длинных волн,
благодаря чему микроскопическое
изображение в отраженных ультрафиолетовых
лучах получается очень контрастным.
При
освещении препарата ультрафиолетовым
излучением микроскопическое изображение
помимо перечисленных выше эффектов,
строится также за счет люминесценции,
что позволяет наглядно выявить в
микропробе компоненты-люминофоры и их
пространственное распределение, а также
получить информацию об их составе по
основным люминесцентным характеристикам
— цвету и интенсивности свечения.
Инфракрасная
микроскопия. Осуществляется на специальных
инфракрасных микроскопах, снабженных
электронно-оптическими преобразователями.
Фотофиксация инфракрасного изображения
не требует ни специальных приборов, ни
осветителей. На обычном световом
микроскопе с лампой накаливания в
качестве источника света можно
фотографировать микроскопическое
изображение в инфракрасных лучах, если
применять фотопластинки, чувствительные
в инфракрасной области 0,8-1,5 мкм.
Наводка
на резкость из-за различий в величине
фокусного расстояния объективов в
видимой и инфракрасной областях требует
соблюдения тех же правил, что и при
обычной фотосъемке на инфракрасных
фотоматериалах.
Иммерсионная микроскопия. Применяется для увеличения разрешающей способности метода световой микроскопии. Разрешающая способность системы светооптической микроскопии определяется длиной волны видимого света и числовой апертурой системы. Числовая апертура показывает величину угла максимального конуса света, попадающего в объектив, и зависит от оптических свойств (преломляющей способности) среды между объектом и линзой объектива. Погружение объектива в среду (минеральное масло), имеющую высокий коэффициент преломления, близкий к таковому у стекла, препятствует рассеиванию света от объекта. Таким образом, достигается увеличение числовой апертуры и соответственно разрешающей способности. Для иммерсионной микроскопии применяют специальные иммерсионные объективы, маркированные черной полосой и снабженные меткой (МИ — масляная иммерсия).
Фазово-контрастная микроскопия. Предназначена для изучения нативных (живых и неокрашенных) препаратов за счет повышения их контрастности. При прохождении света через окрашенные объекты происходит изменение амплитуды световой волны, а при прохождении через неокрашенные объекты — фазы световой волны, что используют для получения высококонтрастного изображения. Для повышения контрастности фазовые кольца покрывают ме-
таллом, поглощающим прямой свет, не влияя на сдвиг фазы. В оптической системе микроскопа применяют специальный конденсор с револьвером диафрагм и центрирующим устройством. Неокрашенные объекты выглядят темными на светлом поле (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).
Темнопольная микроскопия. Применяется для прижизненного изучения микробов в нативных неокрашенных препаратах. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при боковом освещении частиц, взвешенных в жидкости (эффект Тиндаля). Для этого используют темнопольный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала. При этом способе освещения лучи от осветителя падают на объект, сбоку, а в линзы микроскопа поступают только рассеянные лучи. В результате на темном фоне (неосвещенном поле зрения) видны ярко светящиеся частицы (микроорганизмы). С помощью темнопольной микроскопии изучают препараты типа «раздавленная капля». Предметные стекла должны быть не толще 1,1-1,2 мм, покровные — 0,17 мм, без царапин и загрязнений. При качестве приготовлении препарата следует избегать наличия пузырьков и крупных частиц (эти дефекты будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат).
Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия Метод основан на явлении фотолюминесценции. Люминесценция (флюоресценция) — это способность некоторых объектов или веществ светиться при воздействии ультрафиолетового или другого коротковолнового излучения. При этом испускаемые световые волны длиннее волны, вызывающей свечение. Иными словами, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра. Например, если индуцирующее излучение синее, то образующееся сторону, свечение может быть красным или желтым. Различают первичную и вторичную люминесценцию. Первичная люминесценция (биолюминесценция) наблюдается без предварительного окрашивания за счет собственных люминесцирующих веществ, вторичная — возникает после окрашивания флюорохромами (ауромин, корифосфин).
Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ: возможностью исследовать живые микробы и обнаруживать их в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой степени контрастности. Люминесцентная микроскопия нашла широкое применение для визуализации результатов иммунохимических реакций, основанных на специфическом взаимодействии меченых флюоресцирующими красителями антител с антигенами изучаемого объекта.
Электронная микроскопия. Для построения изображения в электронной микроскопии используют поток электронов, что позволяет изучить объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа. В качестве «линз», фокусирующих 8. электроны, служит электромагнитное поле, создаваемое электромагнитными катушками. Изображение в электронном микроскопе наблюдают на флюоресцирующем экране и фотографируют. Объекты при электронной микроскопии находятся в глубоком вакууме, поэтому подвергаются фиксации и специальной обработке. Кроме того, они должны быть очень тонкими, так как поток электронов сильно поглощается объектом. В связи с этим в качестве объектов используют ультратонкие срезы толщиной 20-50 нм, помещенные на тончайшие пленки. Разрешающая способность электронных микроскопов значительно выше, чем световых, и достигает 15 нм, что позволяет получить полезное увеличение в миллионы раз.
Наиболее широко используются два способа электронной микроскопии: просвечивающая (трансмиссивная) и сканирующая. Просвечивающая электронная микроскопия применяется для изучения ультратонких срезов микробов, тканей, а также строения мелких объектов (вирусов, жгутиков и др.), контрастированных фосфорно-вольфрамовой кислотой, уранилацетатом, напылением металлов в вакууме и др. Сканирующая электронная микроскопия применяется для получения трехмерного изображения поверхности исследуемого объекта.
5. Устройство биологического микроскопа
Для микробиологических исследований используют различные виды световой микроскопии: иммерсионная, темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная и др. Для световой микроскопии используют различные виды микроскопов, которые подразделяются на студенческие, рабочие, лабораторные, исследовательские, различающиеся по конструкции и комплектации оптикой. Отечественные микроскопы («Биолам», «Бимам», «Микмед», МБР-1, МБИ-2 и др.) имеют обозначения, указывающие, к какой группе они относятся (С — студенческие, Р — рабочие, Л — лабораторные, И — исследовательские); комплектация обозначается цифрой.
Увеличение изображения достигают системой линз конденсора, объектива и окуляра. Конденсор, расположенный между источником света и изучаемым объектом, собирает лучи света в поле микроскопа. Объектив создает изображение поля микроскопа внутри тубуса. Окуляр увеличивает это изображение и делает возможным его восприятие глазом. Предел разрешения микроскопа (минимальное расстояние, на котором различимы два близко расположенных объекта) определяется длиной световой волны и апертурой линз. Теоретически возможный предел разрешения светового микроскопа равен 0,2 мкм; реальное разрешение можно повысить за счет увеличения апертуры оптической системы, например, путем увеличение коэффициента преломления. Коэффициент преломления (иммерсии) жидких сред больше коэффициента преломления воздуха (n=1.0), что используется для увеличения предела разрешения. В качестве иммерсионных сред используют глицерин, иммерсионное масло (кедровое или синтетическое), препятствующие рассеиванию света от объекта.
В микроскопе различают две части: механическую и оптическую. К механической части относятся: штатив (состоящий из основания и тубусодержателя), тубус с револьвером для крепления и смены объективов, предметный столик, механизмы для грубого (макровинт) и тонкого (микровинт) регулирования изображения. Оптическая часть микроскопа представлена объективами, окулярами и осветительной системой, которая, в свою очередь, состоит из расположенных под предметным столиком конденсора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую сторону, а также автономного или встроенного осветителя.
Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. В оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Один из них помещают перед конденсором. Он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, который установлен после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют освещение препаратов как сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен — возбуждение свечения препарата не является простым отражением света). Его часто используют совместно с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете. Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Такое многообразие применений объясняется очень высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне. Кроме того, информация о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения, имеет огромную ценность.
ИЗУЧЕНИЕ УСТРОЙСТВА МИКРОСКОПА ИЗМЕРЕНИЕ ВЕЛИЧИНЫ МИКРОСКОПИРУЕМОГО ОБЪЕКТА.
Микроскоп – оптический прибор, предназначенный для получения увеличенных изображений малых объектов, невидимых невооруженным глазом. Нормальный глаз человека на расстоянии наилучшего зрения (25 см) может различить мелкую структуру, состоящую из линий или точек при условии, что они находятся друг от друга на расстоянии не меньше 0,07 мм. Размеры же бактерий, органических клеток, мелких кристаллов и т.д. значительно меньше этой величины. Для обнаружения и изучения таких объектов используются типы микроскопов. Оптическая схема микроскопа состоит из двух частей: объектива и окуляр (рис 1). Объектив представляет систему короткофокусных линз, которая предназначена для ослабления сферической и хроматической аберрации. Окуляр микроскопа состоит из нескольких линз. Ход лучей в микроскопе показан на рис 2. На рисунке 1 изображен общий вид. Его главные части: основание, коробка с микрометрическим механизмом 9, предметный столик 10, револьвер 11 с объективами 5, конденсор 2 и окуляр 7.
Оптическая схема состоит из 2 частей: осветительной и наблюдательной. В осветительную часть входит: зеркало 1, конденсатор с ирисовой диафрагмой 3 и объемный светофильтр 4. В наблюдательную – объектив, призам 6 и окуляр, соединненые в тубусе микроскопа.
Рассматриваемый объект АВ, помещенный вблизи главного фокуса объектива образует за объективом действительное, обратное, увеличенное изображение
, расположенное между фокусом и оптическим центром Ок окуляра. При рассмотрении этого изображения в окуляр, как в лупу, оно будет еще более увеличенным, мнимым и прямым. В конечном счете микроскоп дает изображение А2В2, которое является обратным по отношению к предмету АВ. Линейное увеличение микроскопа
равно произведению увеличений, даваемых объективом и окуляром:
Увеличение микроскопа не может быть сколь угодно большим, и его значение не превышает 3000. Это связано с ограниченной разрешающей способностью микроскопа, обусловленной дифракционными явлениями, как изображение любого предмета есть результат дифракции и интерференции рассеянного объектом света. Разрешающей способностью называют свойства оптической системы давать раздельное изображение двух близко расположенных светящихся или освещенных точек объекта (элемента структуры). Разрешающую способность принято измерять величиной:
R = 1/
— предел разрешения, т.е. наименьшее возможное расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно.
Применяя это понятие к условиям микроскопирования биологических объектов, можно считать, что предел разрешения обуславливает наименьшую величину тех структурных деталей, которые могут различаться в препарате. Как видно из формулы
, разрешающая способность микроскопа тем больше, чем меньше его предел разрешения.
Теоретически доказано, что предел разрешения можно определить по формуле
,
— длина волны света, n – показатель преломления среды, между предметом и объективом и объективом,
Произведение: n – sin (
) — называют угловой апертурой.
Очевидно, чем выше разрешающая способность, тем более мелкие детали можно рассмотреть. Повышение разрешающей способности оптического микроскопа достигается уменьшением длины волны света, с помощью которого производится исследование, например, путем применения ультрафиолетового излучения (для этого применяется специальный микроскоп) и увеличением числовой апертуры микроскопа. Для чего необходимо:
1. Использовать иммерсионный объектив, у которого пространство между наблюдаемым предметом и входной линзой заполняется жидкостью с показателем преломления близким показателю преломления стекла. (воздух n = I, глицерин n = 1,45, кедровое масло n = 1,51).
2. Использовать объектив с большим апертурным углом. Величина апертурного угла указана на объективе. Например, увеличение = 8, то апертурный угол равен 0,2.
7. Э КСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
1. Познакомьтесь с главными частями микроскопа.
2. Подготовьте к работе осветительную часть микроскопа: установите тубус микроскопа в удобное для наблюдения положение и закрепите винтом. Схема объектива производится поворотом пистолета до фиксированного положения.
3. Подготовьте к работе осветительную часть: наблюдая в окуляр, установите зеркало так, чтобы отраженный луч светофильтра прошел через светофильтр, диафрагму, конденсатор, исследуемый объект (камера Горяева, рис.3) и попал в объектив. Диафрагму установите так, чтобы освещаемое поле было не очень ярким.
4. Занесите в таблицу основные характеристики объективов и окуляров: заводской номер, увеличение, числовую апертуру.
5. Определите увеличение микроскопа для каждого объектива окуляра.
Величину микроскопируемого объекта можно определить при помощи окулярного микрометра, который представляет собой короткую шкалу (или сетку) с делениями от 0,1 мм, нанесенную на круглую стеклянную пластинку. Он помещается между линзами окуляра так, чтобы шкала находилась в одной плоскости с изображением
Пусть изображение объекта, рассматриваемого в микроскоп, имеет длину равную n делениям окулярного микрометра. Если бы со шкалой совпадал сам предмет, то его длина была бы равна 0,1 n мм, т.к. деление шкалы равно 0,1 мм. Но со шкалой совпадает не сам предмет, а его изображение, увеличенное объективом в
раз. Поэтому истинная L длина предмета будет в N раз меньше длины изображения.
1. Определите размеры большого и малого квадратов камеры Горяева (рис.4), используя объективы с увеличениями 8 и 40.
2. Используя объективы с увеличением 8 и 40, определите размеры эритроцитов крови лягушки.
Ультрафиолетовая микроскопия. Особенности, приемущества, недостатки.
Ультрафиолетовая
микроскопия основана на способности
некоторых веществ, входящих в состав
живых клеток, микроорганизмов или
фиксированных, но не окрашенных,
прозрачных в видимом свете тканей,
поглощать УФ-излучение с определенной
длиной волн (400—250 нм).
Этим свойством обладают высокомолекулярные
соединения, такие как нуклеиновые
кислоты, белки, ароматические кислоты
(тирозин, триптофан, метилалании),
пуриновые и пирамидиновые основания и
др. С помощью ультрафиолетовой микроскопии
уточняют локализацию и количество
указанных веществ, а в случае исследования
живых объектов — их изменения в
процессе жизнедеятельности.
33.
Электронная микроскопия. Структура
электронного микроскопа, строение
магнитных линз. Предел разрешения
электронного микроскопа. Факторы
влияющие на предел разрешения микроскопа.
Почему замена пучка света на поток
электронов дает возможность резко
увеличить разрешающую способность
микроскопа?
Электро́нный
микроско́п (ЭМ) —
прибор, позволяющий получать изображение
объектов с максимальным увеличением
до 106 раз,
благодаря использованию, в отличие от
оптического микроскопа, вместо светового
потока пучка
электронов с
энергиями 200 В ÷ 400 кэВ и
более (например,просвечивающие
электронные микроскопы высокого
разрешения с ускоряющим напряжением 1
МВ). Разрешающая
способность электронного
микроскопа в 1000÷10000 раз превосходит
разрешение светового
микроскопа и
для лучших современных приборов может
быть меньше одного ангстрема.
Для получения изображения в электронном
микроскопе используются специальные магнитные
линзы,
управляющие движением электронов в
колонне прибора при помощи магнитного
поля.
ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ,
совокупность электронно-зондовых
методов исследования
микроструктуры твердых
тел,
их локального состава и микрополей
(электрических, магнитных и др.) с
помощью электронных
микроскопов (ЭМ)
— приборов, в к-рых для получения увелич.
изображений используют электронный
пучок.
Очень распространены
объекты,структурные элементы которых
имеют размеры несколько десятков
ангстрем,что значительно меньше
разрешающей способности обычного
светового микроскопа. Изучение таких
ультраструктур возможно с помощью
электронного микроскопа,обладающего
большей разрешающей способностью,чем
обычный световой микроскоп. В основе
использования электронного микроскопа
лежит использование волновых свойств
электронов и возможность их фокусировки. Любой
движущейся частице,в том числе и
электрону,присущи волновые
свойства(преломление,отражение,дифракция
и интерфернция). Для свободного движения
электронов необходимо создание магнитного
поля. Магнитное поле позволяет фокусировать
электронные лучи и получать равные по
величине электронные изображения
предметов. Магнитную линзу можно сделать
и увеличивающей. Для этого пользуются
сильным неоднородным магнитным
полем,полученного от короткого соленоида
с током,имеющего большое число
витков. Большим увеличением обладает
панцирная магнитная линза с полюсными
наконечниками. Представляет собой
соленоид,находящийся внутри двух
железных цилиндров,внутреннего и
наружного,соединённых железными
основаниями. Создаётся увеличение в
20000 раз. Электронный микроскоп состоит
из оптической системы,вакуумной
установки,установки электрического
питания и пульта управления. Ход
лучей:Источник освещения-конденсорная
линза-объект микроскопического
исследования-объективная линза-промежуточное
изображение объекта-проекционная
линза-увеличение участка промежуточного
изображения.ла
разработана Аббе. Если в качестве объекта
использовать дифракционную решётку,а
еёизображение бесполезное увеличение. Предель
2.10 Метод тёмного
поля. Ультрамикроскопия. УФ-микроскопия
и её преимущества.
Обширную группу
микрокопирования составляют
объекты,содержащие структурные элементы
размерами порядка нескольких сотен
ангстрем,что существенно меньше предела
разрешающей способности обычного
светового микроскопа со светлым
полем. Примерами могут являться пылинки
в воздухе,совокупность твёрдых частиц
в жидкости. Таким образом они воспринимаются
как визуально,так и спомощью обычного
светового микроскопа как однородные. Для
обнаружения таких частиц используют
обычный микроскоп,в котором осуществляется
принцип тёмного поля. В основе этого
метода лежит рассеивание света на
ультрамалых частицах. Используют
специальные конденсоры,затемнённые в
центре,которые приспособлены для
бокового освещения объекта. Принцип
тёмного поля можно осуществить с помощью
кружочка чёрной бумаги,вкладывая его
между линзами обычного конденсора. Диаметр
кружка должен быть такой,чтобы осталась
не закрытой только незначительная
перефирическая часть линзы. Таким оьразом
прямые лучи устраняются,а лучи
дифрагированные ультрамалыми
частицами,сохраняются,что и позволяет
их обнаружить. Существенный недостаток
метода тёмного поля-невозможность
изучения с его помощью структуры
обнаруживаемых ультрамалых частиц.
2.11 Метод фазового
контраста.
В настоящее время
структуры неконтрастных объектов часто
изучают с помощью обычного светового
микроскопа,снабжённого фазовой
приставкой. Этот метод,получивший
название метода фазового контраста,позволяет
изучить структуры неконтрастных объектов
путём увеличения контраста получаемого
изображения без непосредственного
воздействия на сам объект. При встрече
света с любой неоднородностью,в частности
с бактерией,происходят два явления
изменения фаз колебаний световых волн
и их дифракция. Происходит воздействие
на основные и добавочные волны. Для этого
используются пластинки различных
конструкций. Они называются фазовыми. Такие
фазовые пластинки устанавливаются в
фокальной плоскости объектива
микроскопа,то есть практически вплотную
к объективу. Сущность метода сводится
к созданию контраста интенсивностей в
окончательном изображении неконтрастного
объекта,путём воздействия на его
первичное изображение. С помощью этого
метода возможно проводить наблюдение
живых микроорганизмов-бактерий.
Соседние файлы в папке Физика зачёт
Ультрафиолетовая
микроскопия основана на способности
некоторых веществ, входящих в состав
живых клеток, микроорганизмов или
фиксированных, но не окрашенных,
прозрачных в видимом свете тканей,
поглощать УФ-излучение с определенной
длиной волн (400- 250 нм). Этим свойством
обладают высокомолекулярные соединения,
такие как нуклеиновые кислоты, белки,
ароматические кислоты (тирозин, триптофан,
метилаланин), пуриновые и пирамидиновые
основания и др. С помощью ультрафиолетовой
микроскопии уточняют локализацию и
количество указанных веществ, а в случае
исследования живых объектов — их изменения
в процессе жизнедеятельности.
1 Особенности разных видов микроскопии
Основными задачами
микроскопии являются следующие:
На сегодняшний
день наиболее используемой является
световая микроскопия.
Световая
микроскопия
обеспечивает увеличение до 2–3 тысяч
раз, цветное и подвижное изображение
живого объекта, возможность микрокиносъемки
и длительного наблюдения одного и того
же объекта, оценку его динамики и химизма.
Изображение
в световом микроскопе формируется
вследствие того, что объект и различные
его структуры избирательно поглощают
свет с различной длиной волны (абсорбционный
контраст) или вследствие изменения фазы
световой волны при прохождении света
через объект (фазовый контраст).
Основными
характеристиками любого микроскопа
являются разрешающая способность и
контраст. Разрешающая
способность
– это минимальное расстояние, на котором
находятся две точки, демонстрируемые
микроскопом раздельно. Разрешение
человеческого глаза в режиме наилучшего
видения равно 0,2 мм. Контраст
изображения –
это различие яркостей изображения и
фона. Если это различие составляет менее
3–4 %, то его невозможно уловить ни глазом,
ни фотопластинкой; тогда изображение
останется невидимым, даже если микроскоп
разрешает его детали. На контраст влияют
как свойства объекта, изменяющие световой
поток по сравнению с фоном, так и
способности оптики уловить возникающие
различия в свойствах луча. Возможности
светового микроскопа ограничены волновой
природой света. Физические свойства
света – цвет (длина волны), яркость
(амплитуда волны), фаза, плотность и
направление распространения волны
изменяются в зависимости от свойств
объекта. Эти различия и используются в
современных микроскопах для создания
контраста.
Увеличение
микроскопа
определяется как произведение увеличения
объектива на увеличение окуляра. У
типичных исследовательских микроскопов
увеличение окуляра равно 10, а увеличение
объективов – 10, 40 и 100. Соответственно,
увеличение такого микроскопа составляет
от 100 до 1 000. Некоторые из микроскопов
имеют увеличение до 2 000. Еще более высокое
увеличение не имеет смысла, так как при
этом разрешающая способность не
улучшается. Напротив, качество
изображения ухудшается.
Числовая апертура
используется для выражения разрешающей
способности оптической системы. Числовая
апертура – это оптический «охват»
линзы, она является мерой количества
света, попадающего в линзу. Числовая
апертура объектива указана на его
оправе. Апертура конденсора должна
соответствовать числовой апертуре
объектива. Числовая апертура любой
линзы, граничащей с воздухом (т.е. «сухой
системы»), не может превысить 1, так как
показатель преломления воздуха равен
1. Числовую апертуру можно повысить,
если увеличить показатель преломления
среды между фронтальной линзой объектива
и предметным стеклом, приблизив его к
показателю преломления стекла (1,5). Для
этого между фронтальной линзой объектива
и исследуемым объектом помещают каплю
жидкости с показателем преломления
большим, чем показатель преломления
воздуха, например, каплю воды (n
= 1,3), глицерина (n
= 1,4) или кедрового (иммерсионного) масла
(n
= 1,5). Для каждой из указанных выше
жидкостей выпускаются специальные
объективы, которые называются
иммерсионными.
Световая
микроскопия включает
обычную просвечивающую
микроскопию (светло-, темнопольную),
фазово-контрастную, люминесцентную. В
последнее время разработаны и другие
способы микроскопии и микроскопы –
инверсионная
и
конфокальная лазерная сканирующая
микроскопия.
Светлопольная
микроскопия
позволяет исследовать объекты в
проходящем свете в светлом поле. Данный
вид микроскопии предназначен для
исследования морфологии, размеров
клеток, их взаимного расположения,
структурной организации клеток и других
особенностей. У светового микроскопа
максимальная разрешающая способность
составляет 0,2 мкм, что обеспечивает
высокоточное увеличение микроскопа до
1500х.
Фазово-контрастная
микроскопия
позволяет более четко наблюдать живые
прозрачные объекты, которые имеют
коэффициенты преломления, близкие к
коэффициентам преломления среды.
Действие фазово-контрастного микроскопа
основано на интерференции света в
плоскости изображения, обусловленной
сдвигом по фазе (при использовании
фазового кольца в апертурной диафрагме).
При фазово-контрастной микроскопии
часто применяют биологические микроскопы
с обратным расположением оптики –
инвертированные микроскопы. У таких
микроскопов объективы расположены
снизу, а конденсор – сверху.
С помощью
фазово-контрастной микроскопии изучают
форму, размеры, взаимное расположение
клеток, их подвижность, размножение,
прорастание спор микроорганизмов и т.
д. Благодаря
применению этого способа микроскопии
контраст живых неокрашенных микроорганизмов
резко увеличивается и они выглядят
темными на светлом фоне (позитивный
фазовый контраст) или светлыми на темном
фоне (негативный фазовый контраст).
Темнопольная
микроскопия
основана на освещении объекта косыми
лучами света. При таком освещении лучи
не попадают в объектив, поэтому поле
зрения выглядит темным. Такое освещение
препарата достигается использованием
специального темнопольного конденсора.
Темнопольная микроскопия является
очень простым, но эффективным методом
и хорошо подходит для получения
изображения живых и неокрашенных
биологических образцов. Учитывая
простоту установки, качество получаемых
изображений весьма хорошее.
При микроскопировании
в темном поле можно увидеть объекты,
величина которых измеряется сотыми
долями микрометра, что находится за
пределами разрешающей способности
обычного светлопольного микроскопа.
Однако наблюдение за объектами в темном
поле позволяет исследовать только
контуры клеток и не дает возможности
рассмотреть их внутреннюю структуру.
Люминесцентная
(флуоресцентная) микроскопия
основана на способности ряда веществ
биологического происхождения или
некоторых красителей светиться при их
освещении невидимым ультрафиолетовым
или синим светом. При использовании
ультрафиолетового света разрешающая
способность микроскопа может достигать
0,1 мкм.
Клетки
микроорганизмов обрабатывают специальными
красителями – флуорохромами (акридиновый
оранжевый, примулин, родамин и др.) в
виде сильно разбавленных водных
растворов: 1:500–1:100 000. Такие растворы
слабо токсичны, что дает возможность
изучать неповрежденную клетку. В
зависимости от химического состава,
клеточные структуры в разной степени
адсорбируют красители и люминесцируют
различным образом. Кроме того, флуорохромы
неодинаково адсорбируются живыми и
мертвыми клетками. Это позволяет
использовать данный вид микроскопии
для цитологических и иммунологических
исследований, определения жизнеспособности
клеток и т. д.
Электронная
микроскопия
позволяет обнаружить объекты, которые
не разрешаются при использовании
световых или ультрафиолетовых лучей.
Теоретически
разрешение
просвечивающего
электронного микроскопа
составляет 0,002 нм; реальное разрешение
современных электронных
микроскопов
приближается к 0,1 нм. На практике
разрешение для биологических объектов
достигает 2 нм.
Короткая длина
волны электронов позволяет различить
объекты размером 0,5–1,0 нм. В современных
электронных микроскопах на экране
достигается увеличение 5000– 200 000.
Благодаря столь высокому разрешению
становится возможным выявление деталей
бактериальных структур. Например, с
помощью напыления солей тяжелых металлов,
окружающих бактерию и проникающих в
поверхностные неровности, получают
контрастирование за счет дифференциальной
задержки электронов. Этот эффект получил
название негативного
контрастирования.
Электронный
микроскоп, в котором изображение
формируется благодаря прохождению
(просвечиванию) электронов через образец,
называют просвечивающим
(или трансмиссионным).
В сканирующем
электронном микроскопе (растровая
электронная микроскопия (РЭМ)
пучок электронов быстро сканирует
поверхность образца, вызывая излучение,
которое формирует изображение на
светящемся экране. Для РЭМ характерны
высокая
разрешающая способность, большой
диапазон увеличений (до 100 000 и выше),
большая глубина фокусировки (~100 мкм),
многообразие режимов работы. Сканирующий
микроскоп дает картину поверхностей и
позволяет получать трехмерное изображение.
Лазерная
конфокальная микроскопия
дает возможность получить отчетливое
изображение и наблюдать объекты в фокусе
по всему полю. Данный
метод пригоден лишь для исследования
самосветящихся (флуоресцентных) объектов.
При сочетании
с компъютерной техникой возможна
пространственная реконструкция
изучаемого объекта.
В конфокальном лазерном сканирующем
микроскопе изображения внутренних
сечений формируются за счет сканирования
сфокусированным лазерным пучком от
разных (405, 488, 532, 635 нм) лазеров и
пространственной фильтрации излучения.
При использовании сканирующей микроскопии
ближнего поля (СМБП) достигается высокая
разрешающая способность. Наименьший
размер элемента, полученного с помощью
СМБП, составляет 20 нм при длине волны
света 0,486 нм. В изображении контролируемого
элемента отсутствуют дифракционные
или интерференционные эффекты,
затрудняющие определение его границ.
Отличительной особенностью СМБП по
сравнению с атомно-силовым микроскопом
является чувствительность к оптическим
характеристикам поверхности контролируемого
образца, длине волны света, люминесценции
и др.
Компьютерная
интерференционная микроскопия
позволяет получить высококонтрастное
изображение при наблюдении субклеточных
структур; во многих случаях применяется
для изучения живых клеток. Принцип
действия автоматизированного
интерференционного микроскопа основан
на интерференции световых пучков
лазерного излучения, отраженного от
опорного зеркала и зеркала, на котором
помещен измеряемый фазовый объект.
Теоретически предельно
достижимая разрешающая способность
может составить в среднем 0,2 нм, практически
она составляет 0,4 мкм.
Рентгеновская
компьютерная томография (РКТ), позитронная
эмиссионная томография
(ПЭТ)
позволяют наблюдать объекты в обычных
условиях.
Соседние файлы в папке Скорина
Инфракрасная микроскопия
Инфракрасная
микроскопия позволяет исследовать
непрозрачные для видимого света и
УФ-излучения объекты путем поглощения
их структурами света с длиной волны
750—1200 нм. Для инфракрасной микроскопии
не требуется предварительной хим.
обработки препаратов. Этот вид М. м. и.
наиболее часто используют в зоологии,
антропологии, других отраслях биологии.
В медицине инфракрасную микроскопию
применяют в основном в нейроморфологии
и офтальмологии.
Стереоскопическая микроскопия
Для исследования
объемных объектов используют
стереоскопическую микроскопию.
Конструкция стереоскопических микроскопов
позволяет видеть объект исследования
правым и левым глазом под разными углами.
Исследуют непрозрачные объекты при
относительно небольшом увеличении (до
120 раз). Стереоскопическая микроскопия
находит применение в микрохирургии, в
патоморфологии при специальном изучении
биопсийного, операционного и секционного
материала, в судебно-медицинских
лабораторных исследованиях.
Электронная микроскопия
Для изучения на
субклеточном и макромолекулярном
уровнях структуры клеток, тканей
микроорганизмов и вирусов используют
электронную микроскопию. Этот М. м. и.
позволил перейти на качественно новый
уровень изучения материи. Он нашел
широкое применение в морфологии,
микробиологии, вирусологии, биохимии,
онкологии, генетике, иммунологии. Резкое
повышение разрешающей способности
электронного микроскопа обеспечивается
потоком электронов, проходящих в вакууме
через электромагнитные поля, создаваемые
электромагнитными линзами. Электроны
могут проходить через структуры
исследуемого объекта (трансмиссионная
электронная микроскопия) или отражаться
от них (сканирующая электронная
микроскопия), отклоняясь под разными
углами, в результате чего возникает
изображение на люминесцентном экране
микроскопа. При трансмиссионной
(просвечивающей) электронной микроскопии
получают плоскостное изображение
структур ,
при сканирующей
– объемное.
Сочетание
электронной микроскопии с другими
методами, например, с радиоавтографией,
гистохимическими, иммунологическими
методами исследования, позволяет
проводить электронно-радиоавтографические,
электронно-гистохимические,
электронно-иммунологические исследования.
Электронная
микроскопия требует специальной
подготовки объектов исследования, в
частности химической или физической
фиксации тканей и микроорганизмов.
Биопсийный материал и секционный
материал после фиксации обезвоживают,
заливают в эпоксидные смолы, режут
стеклянными или алмазными ножами на
специальных ультратомах, позволяющих
получать ультратонкие срезы тканей
толщиной 30—50 нм. Их контрастируют и
затем изучают в электронном микроскопе.
В сканирующем (растровом) электронном
микроскопе изучают поверхность различных
объектов, напыляя на них в вакуумной
камере электронно-плотные вещества, и
исследуют так наз. реплики, повторяющие
контуры образца.
