МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МИКРОСКОП

Новая технология позволит ученым заглянуть в
отдельную клетку

Знание того, как белки ведут себя внутри отдельных клеток
человека, может рассказать нам, будут ли эти клетки жить, умирать
или будет нарушена их функция – это та важная информация, которая
позволит диагностировать болезни.

В настоящее время получение такой детальной информации крайне
затруднительно из-за несовершенства аналитического метода,
требующего проанализировать как минимум сотни, если не тысячи,
клеток из взятых образцов.

Теперь, однако, ученые Тихоокеанской северо-западной национальной
Лаборатории (PNNL) создали «молекулярный микроскоп», способный
обнаружить и идентифицировать белки внутри образцов, состоящих
всего лишь из нескольких клеток или даже из одной единственной
клетки, и применять такой прибор для того, чтобы различить ткань,
пораженную болезней от здоровой.

Новый аппарат может анализировать образцы ткани в 500 раз
меньшие, чем те, которые требовались для идентификации
протеина  по другим технологиям. В одном из опытов ученые с
помощью нового аппарата смогли  обнаружить примерно 650
белков в единичной клетке ткани легкого человека.

В другом опыте они использовали этот аппарат для диагностики
небольших образцов ткани поджелудочной железы человека в
лабораторной чашке Петри, чтобы выявить, была ли ткань
диабетической или здоровой.

(Больные панкреатические клетки могут блокировать производство
инсулина и вызывать диабет первого типа).

Исследователи также применили эту технологию к
распознаванию белков, извлеченных их небольшого количества клеток
здорового мозга человека, легких, печени и матки. Они надеются,
что такой подход приведет к  более целенаправленным и
персонифицированным диагнозам заболеваний.

Согласно новой методике сначала отбираются образцы ткани в
микроскопические

ячейки, нанесенных методом травления на поверхность стеклянного
чипа. Затем при помощи автоматизированной руки робота извлеченные
и изолированные белки переносятся в каждое углубление и ученые
для идентификации белков используют  масс- спектрометр.

До сих пор технологии идентификации белка могли давать только
общую картину больших образцов, но не содержали подробной
информации о белках в отдельных клетках или в очень маленьких
скоплений клеток.

«Мы можем теперь для анализа «находить иголку в стоге сена»,
тогда как прежде мы вынуждены были анализировать «иголки и стог
сена» вместе»,- говорит химик Рьян Келли (Ryan Kelly). Он и его
коллега Иинг Жу (Ying Zhu), работают в Тихоокеанской
северо-западной национальной Лаборатории (PNNL) и являются
соавторами исследования, опубликованного прошлым летом в журнале
«Angewandte Chemie».

Главная проблема заключается в том, что работа с образцами столь
малого размера  очень затруднена по той причине, что часть
материала теряется в ходе процесса на каждом этапе работы.

Новая система рассматривает этот вопрос, применяя
микро-скопические ячейки, которые сводят к минимуму область
поверхности, на которую могли бы осесть белки.

Дэвид Гудлетт (David Goodlett), химик из Университета Штата
Мэриленд, который не участвовал в работе, называет этод способ
грандиозным прорывом вперед.

Ученые разработали “изящное решение этой проблемы», — говорит он.

Научные работники уже применяют эту технологию для идентификации
белков отдельных клеток опухоли, циркулирующих в кровотоке
пациентов с раком простаты. Способность обнаруживать такие малые
составляющие в этих клетках могла бы быть полезна для объяснения
факта, почему некоторые нездоровые ткани становятся резистентными
к лекарствам.

источник Журнал Саентифик Американ №12 2018

Перевод: Энигма Л. Н.

Команда Эрика Бетцига создала новый микроскоп, способный снимать живые объекты микромасштаба в режиме реального времени. О его возможностях рассказано на страницах журнала Science. В сухом кратком резюме перечислено, что новый микроскоп (рис. 1) позволяет: регистрировать перемещения одной биомолекулы, увидеть процессы, происходящие внутри клетки, проследить поведение отдельных клеток в окружающем матриксе, а также взаимодействие клеток между собой в многоклеточных системах. В реальности же при взгляде сквозь окуляр нового микроскопа открывается новый захватывающий мир.

Журнал Science на этой неделе пригласил своих читателей в кино: в статье Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution и дополнительных материалах к ней демонстрируются более 20 видеороликов. И это не простые видеоклипы — это микро- или даже наномир, снятый в режиме реального времени. Работа стала результатом труда большого коллектива авторов, среди которых есть и недавний лауреат Нобелевской премии по химии Эрик Бетциг.

На это зрелище действительно стоит посмотреть: перед глазами открывается целый мир движущихся молекул внутри живой клетки. Вот клетка культуры HeLa, а на ее поверхности вытягиваются, дрожат и качаются тонкие нити-филоподии (см. Filopodia). Конечно, превосходные сверхкачественные изображения этих клеток с филоподиями имеются во множестве, но сейчас можно увидеть эти изображения «живыми». Это примерно как мчащийся поезд на широком экране в сравнении с его фотографией.

Куда направляются молекулы белков микротрубочек во время последовательных фаз клеточного деления? — пожалуйста, смотрите другой видеоролик. Вот движутся хромосомы, растут микротрубочки, митохондрии взаимодействуют с эндоплазматическим ретикулумом. Последнее особенно интересно: видно, как эндоплазматический ретикулум преображается в особую «цистерну» (см. L. Lu, M. S. Ladinsky, T. Kirchausen, 2009. Cisternal Organization of the Endoplasmic Reticulum during Mitosis), вмещающую митохондрии, и можно отследить специфические перемещения и тех, и других. Никакие графики и никакая фотография не передает живой динамики клеточного деления (рис. 2).

Некоторые из представленных видео не только поучительны, но и весьма забавны: хорошо видны суетливые движения инфузории Tetrahymena thermophila или видно, как прокладывает свой извилистый путь клетка пронейтрофила (HL-60), буквально продираясь сквозь волокна коллагена (рис. 3). В первом случае удается точно оценить число биений жгутиков, что важно для сопоставления скоростей биохимических и фенетических проявлений. Второй пример еще более актуален: это модель нейтрофила, который направляется сквозь трехмерную ткань, укрепленную коллагеном, к зараженному участку.

Достойно описать словами эти ролики невозможно. Можно лишь привести краткий перечень новых наблюдений, открытий, которые позволяет сделать новая техника. Но это будет скорее напоминать рекламу нового микроскопа, которая уже существует в достаточно культурном и красивом виде (правда, по-английски). В этом тексте приводятся слова Э. Бетцига, который оправдывает быструю коммерциализацию новой техники:

Чтобы адаптировать рабочий высокотехнологичный прототип к современным возможностям изображения, потребовались колоссальные усилия. В конечном итоге, коммерциализация — это необходимый завершающий шаг, призванный убедить научное общество, что новый продукт открывает широкие исследовательские перспективы.

(It takes a huge amount of effort to move from a successful high-tech prototype to broader adoption of an imaging technology. Ultimately, commercialization is the crucial last step to ensuring that these technologies can have broad impact in the research community.)

Действительно, понятно, что новый микроскоп и вправду исключительно перспективен, но его рекламой пусть занимается компания Carl Zeiss, которой теперь принадлежат права на эту технику. Здесь имеет смысл лишь отметить, чем этот микроскоп отличается от всех других.

При микроскопировании живых объектов возникают две основных проблемы. Во-первых, чтобы получать изображения с высоким разрешением, нужно объект осветить; но чем выше интенсивность освещения, тем быстрее объект умирает. Во-вторых, чтобы получить изображения объекта, меняющего свою позицию в пространстве, нужны вычисления, которые занимают время; значит, чем быстрее движется объект, тем меньше вероятность получить его изображение в хорошем разрешении. Эти проблемы взаимосвязаны, так как хорошее разрешение требует большего освещения и, значит, предполагает более короткий промежуток жизни изучаемого объекта под микроскопом. Обе эти проблемы удалось обойти, применив для освещения световую плоскость, созданную лучами Бесселя (рис. 4).

Освещение световой плоскостью используется во флуоресцентных микроскопах, но вот лучи Бесселя были предложены для микроскопирования только в 2011 году все той же командой Эрика Бетцига (см. статью T. A. Planchon et al., 2011. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination). За прошедшее время эта аппаратура была усовершенствована за счет особого метода разделения световой плоскости оптической решеткой на отдельные параллельные лучи. Каждый луч имеет меньшую интенсивность и, соответственно, производит на клетку меньший повреждающий эффект. Придумана также система, позволяющая быстро продуцировать образ объекта. Тут задействованы соотношения между длинами волны, индуцированной скоростью вибрации лучей и сглаживанием результирующих изображений. ( Для более точной информации об этой технологии лучше обратиться к дополнительным материалам к статье.)

Хотелось бы надеяться, что кому-нибудь из читателей «Элементов» удастся посмотреть в этот чудесный микроскоп. Это проще, чем полететь на Марс, а впечатления, возможно, сопоставимы.

Синтез одной молекулы

В умелых руках и СТМ и АСМ превращаются из приборов, способных изучать вещество, в приборы, способные направленно изменять строение вещества. С помощью этих устройств уже удалось получить «самые маленькие химические лаборатории», в которых вместо колбы используется подложка, а вместо молей или миллимолей реагирующих веществ — отдельные молекулы.

Например, в 2016 году международная группа ученых во главе с Такаси Кумагаи использовала бесконтактную атомно-силовую микроскопию для перевода молекулы порфицена из одной ее формы в другую (Nature Chemistry, 2016, 8, 935–940, doi: 10.1038/nchem.2552). Порфицен можно рассматривать как модификацию порфирина, во внутреннем цикле которого содержится четыре атома азота и два атома водорода. Колебания зонда АСМ передавали молекуле порфицена достаточно энергии для переноса этих водородов от одних атомов азота к другим, и в результате получалось «зеркальное отражение» этой молекулы (рис. 8).

Группа под руководством неутомимого Лео Гросса также показала, что возможно инициировать реакцию отдельно взятой молекулы, — они превратили дибромантрацен в десятичленный циклический диин (рис. 9; Nature Chemistry, 2015, 7, 623–628, ). В отличие от Кумагаи с соавторами, они использовали сканирующий туннельный микроскоп для активации молекулы, а за результатом реакции следили с помощью атомно-силового микроскопа.

Комбинированное применение сканирующего туннельного микроскопа и атомно-силового микроскопа позволило даже получить молекулу, которую невозможно синтезировать с помощью классических приемов и методов (Nature Nanotechnology, 2017, 12, 308–311, ). Это триангулен — нестабильный ароматический бирадикал, существование которого было предсказано шесть десятилетий назад, но все попытки синтеза были неудачными (рис. 10). Химики из группы Нико Павличека получили искомое соединение, оторвав от его прекурсора два атома водорода с помощью СТМ и подтвердив синтетический результат с помощью АСМ.

Предполагается, что число работ, посвященных применению атомно-силовой микроскопии в органической химии, еще будет расти. В настоящее время все больше ученых пытаются повторить на поверхности реакции, хорошо знакомые «растворной химии». Но, возможно, химики-синтетики начнут воспроизводить в растворе те реакции, которые были первоначально осуществлены на поверхности с помощью АСМ.

Аркадий Курамшин,
кандидат химических наук
«Химия и жизнь» №5, 2017

Принялся Трурль ловить атомы, соскабливать с них электроны, месить протоны, так что лишь пальцы мелькали, приготовил протонное тесто, выложил вокруг него электроны и — за следующий атом; не прошло и пяти минут, как держал он в руках брусочек чистого золота: подал его морде, она же, на зуб брусочек попробовав и головой кивнув, сказала:
— И в самом деле золото, только я не могу так за атомами гоняться. Слишком я большой.
— Ничего, мы дадим тебе особый аппаратик! — уговаривал его Трурль.

Станислав Лем, «Кибериада»

Можно ли с помощью микроскопа разглядеть атом, отличить его от другого атома, проследить за разрушением или образованием химической связи и увидеть, как одна молекула превращается в другую? Да, если это не простой микроскоп, а атомно-силовой. А можно и не ограничиваться наблюдением. Мы живем в то время, когда атомно-силовой микроскоп перестал быть просто окном в микромир. Сегодня этот прибор можно использовать для перемещения атомов, разрушения химических связей, изучения предела растяжения одиночных молекул — и даже для исследования генома человека.

Галанин («Наука и жизнь» №2, 1934 год)
«Наука и жизнь» №10, 2009

Современная наука имеет глубокие корни. Гораздо более глубокие, чем может показаться на первый взгляд. Журнал «Наука и жизнь», основанный в 1890 году и возобновлённый после перерыва в октябре 1934 года, помогает проследить историю развития научно-технической мысли.

Волны и частицы

Какой смысл имеет такое сочетание слов — «электронный микроскоп»? Неужели при помощи электронов можно рассмотреть или фотографировать мелкие предметы в увеличенном виде? Эта попытка заменить световые волны электронами вполне естественно вытекает из взглядов современной физики на сходство между распространением волн и потоком летящих частиц *.

Как были открыты электроны

Представление об электронах как отдельных частичках, могущих в пустоте двигаться с большими скоростями, было создано английскими учёными В. Круксом и Дж. Дж. Томсоном в связи с рядом опытов по прохождению электричества через крайне разреженные газы.

Крукс помещал металлическую пластинку внутри стеклянной трубки, из которой выкачивался газ, и заряжал её до большого напряжения отрицательным электричеством. Если напряжение было достаточно велико, из пластинки во все стороны перпендикулярно к её поверхности начинали исходить какие-то лучи, невидимые глазу, но заставляющие стекло трубки светиться зелёным светом. Обнаружить эти лучи было очень легко, ставя между пластинкой и стеклом какой-нибудь предмет, так как на стекле получалась тень, форма которой ясно указывала, что из пластинки по прямым линиям исходят какие-то лучи, заставляющие стекло светиться (рис. 1).

Чтобы исследовать природу этих лучей, был придуман целый ряд необычайно остроумных опытов, и удалось с полной несомненностью доказать, что эти лучи представляют собой летящие с огромной скоростью частицы электричества, названные электронами.

Как можно управлять движением электронов

На рис. 2 схематично изображена стеклянная трубка, из которой выкачан воздух, снабжённая несколькими электродами, к которым можно подводить электрическое напряжение.

Электрод К (катод) заряжен отрицательно по отношению к пластинке А (анод) настолько сильно, что из него будут вылетать электроны. Обычно катод нагревают до высокой температуры, тогда напряжение между катодом и анодом может быть значительно меньше.

Электроны полетят от электрода к пластинке, и их скорость будет всё время возрастать; если в аноде сделано отверстие, то разогнавшиеся электроны, пролетая через отверстие, будут продолжать лететь с достигнутой скоростью по инерции прямолинейным пучком.

Если вдоль пучка расположить пластинку, покрытую веществом, светящимся от ударов электронов, то этот пучок делается видным в виде узкой светящейся полоски, указывающей путь электронов.

Поставим сверху и снизу от этого пучка летящих электронов две металлические пластинки и зарядим верхнюю пластинку (M) отрицательно, а нижнюю (N) положительно. Тогда электроны, отталкиваясь от верхней и притягиваясь к нижней, изогнут свой путь. Этот изгиб будет вполне похож на изгиб под влиянием силы тяжести струи воды, вытекающей из горизонтальной трубы. Величина изгиба будет зависеть от величины напряжения между пластинками M и N и от скорости электронов. Понятно, чем скорость будет больше, тем изгиб будет меньше и чем напряжение будет больше, тем больше будет и изгиб.

Придавая пластинкам соответствующую форму и меняя напряжение и скорость электронов, получают возможность управлять движением электронов. Надо только точно рассчитать, как эти пластинки будут влиять на полёт электронов. Это довольно трудная задача, но с ней легко может справиться хороший математик. То же отклонение пучка можно сделать при помощи магнитного поля.

Электронная линза

На рис. 3 изображён опыт с электронной линзой, из которого видно, как хорошо удаётся управлять потоком летящих электронов. Из ряда отверстий с левой стороны рисунка выходят несколько расходящихся пучков электронов, дальше они проходят через так называемую электронную линзу, состоящую из заряженных пластинок. Крайние пластинки линзы заряжены отрицательно, а средняя пластинка — положительно. Пучки электронов отклоняются линзой и пересекаются совершенно так же, как лучи света, проходящие через стеклянное оптическое стекло. На среднем рисунке напряжение сделано меньше, и пучки, отклоняясь, делаются параллельными, а на нижнем рисунке (без напряжения) остаются расходящимися.

На практике оказывается гораздо удобнее пользоваться не заряженными пластинками, а катушками, создающими магнитное поле. Влияние магнитных сил на полёт электрона несколько сложнее, но, по существу, ничем не отличается от влияния электрических сил, и при помощи магнитного поля соответственно подобранной катушки, по которой проходит электрический ток, можно также построить электронную линзу.

Электронный микроскоп

Получив возможность построить электронную линзу, нетрудно осуществить и сложный электронный микроскоп.

С внешней стороны электронный микроскоп изображён на рис. 4. Назначение отдельных частей указано на самом рисунке.

Результаты исследования при помощи электронного микроскопа

На рис. 5 представлен снимок, сделанный электронной линзой с нагретого, покрытого окисью катода, испускающего электроны. На снимке видно, что только отдельные части катода испускают электроны. Расположение этих пятен позволяет изучать структуру слоя окиси, что представляет очень большой интерес, так как такие окисные катоды применяются для катодных радиоламп.

На рис. 6 изображён тоновой снимок решётки из тонкой проволоки, причём расстояние между проволочками равно 0,3 мм. Слева — снимок при помощи электронного микроскопа, а справа — снимок при помощи светового микроскопа. Электронный снимок во всяком случае не хуже, чем световой.

Обычный световой микроскоп не может разделить двух точек или чёрточек, если расстояние между ними меньше четверти длины световой волны. Световые волны имеют заметные размеры, и поэтому «разрешающая способность» светового микроскопа достигает не более чем 0,4 μ (мкм, 10–6 м. — Ред.), или 4000 Å (Å — ангстрем = 10–8 см). Предел «разрешающей способности» электронного микроскопа ставится длиной волны того волнового процесса, который, согласно воззрениям современной физики, окружает летящий электрон, — длиной «волн материи» Де-Бройля.

Длина волны материи зависит от скорости летящего электрона и будет тем меньше, чем больше скорость электрона. Поэтому, увеличивая скорость электронов, можно сделать «разрешающую способность» электронного микроскопа почти безграничной. Можно подсчитать, по теории Де-Бройля, что при скорости электронов 750 вольт «разрешающая способность» электронного микроскопа уже достигает 22 ангстрем, а при легко достижимой скорости 75 000 вольт она делается около 2 ангстрем, то есть приближается к размерам атома.

Первые электронные микроскопы были построены всего 2–3 года назад (в начале 1930-х годов. — Ред.), но уже сейчас при их помощи можно получать снимки тонких листочков металла, прозрачных для электронов, с увеличением в 7–12 000 раз.

Электронный микроскоп, возможно, сделается скоро таким же обычным прибором, как световой микроскоп, и трудно сейчас представить, сколь интересные результаты могут быть получены при помощи этого прибора.

* См. статью акад. А. Ф. Иоффе в № 1, 1934 г. (перепечатана в журнале «Наука и жизнь» №10, 2004 год).

Живо по зондам, в погоню за связями

Убедившись, что с помощью АСМ можно увидеть химическую связь, Лео Гросс решил пойти дальше и применить атомно-силовой микроскоп для измерения длин и порядков связей — ключевых параметров для понимания химической структуры, а следовательно, и свойств веществ.

Напомним, что различие в порядках связей указывает на разные значения электронной плотности и различные межатомные расстояния между двумя атомами (говоря проще, двойная связь короче одинарной). В этане порядок связи углерод-углерод равен единице, в этилене — двум, а в классической ароматической молекуле — бензоле — порядок связи углерод-углерод больше единицы, но меньше двух, и считается равным 1,5.

Определить порядок связи гораздо сложнее при переходе от простых ароматических систем к плоским или объемным поликонденсированным циклическим системам. Так, порядок связей в фуллеренах, состоящих из конденсированных пяти- и шестичленных углеродных циклов, может принимать любое значение от единицы до двух. Та же самая неопределенность теоретически присуща и полициклическим ароматическим соединениям.

В 2012 году Лео Гросс совместно с Фабианом Моном показал, что атомно-силовой микроскоп с металлическим бесконтактным зондом, модифицированным монооксидом углерода, может измерять различия в распределении зарядов у атомов и межатомные расстояния — то есть параметры, ассоциированные с порядком связи (Science, 2012, 337, 6100, 1326–1329, ).

Для этого они изучили два типа химических связей в фуллерене — связь углерод-углерод, общую для двух шестичленных углеродсодержащих циклов фуллерена С60, и связь углерод-углерод, общую для пяти- и шестичленного циклов. Атомно-силовой микроскоп показал, что при конденсации шестичленных циклов образуется связь более короткая и с большим порядком, чем при конденсации циклических фрагментов C6 и C5. Изучение же особенностей химического связывания в гексабензокоронене, где вокруг центрального цикла C6 симметрично расположено еще шесть циклов C6, подтвердило результаты квантово-химического моделирования, согласно которым порядок связей С—С центрального кольца (на рис. 4 буква i) должен быть больше, чем у связей, объединяющих это кольцо с периферийными циклами (на рис. 4 буква j). Сходные результаты получили и для более сложного полициклического ароматического углеводорода, содержащего девять шестичленных циклов.

Порядки связей и межатомные расстояния, конечно же, интересовали химиков-органиков, но важнее это было тем, кто занимался теорией химической связи, предсказанием реакционной способности и изучением механизмов химических реакций. Тем не менее и химиков-синтетиков, и специалистов по изучению структуры природных соединений ждал сюрприз: оказалось, что атомно-силовой микроскоп можно применять для установления структуры молекул точно так же, как ЯМР или ИК-спектроскопию. Более того, он дает однозначный ответ на вопросы, с которыми эти методы не в состоянии справиться.

От неживого — к живому

Кантилеверы и зонды атомно-силовых микроскопов можно применять не только для аналитических исследований или синтеза экзотических молекул, но и для решения прикладных задач. Уже известны случаи использования АСМ в медицине, например для ранней диагностики рака, и здесь пионером выступает тот самый Кристофер Гербер, который приложил руку к разработке принципа атомно-силовой микроскопии и созданию АСМ.

Так, Герберу удалось научить АСМ определять точечную мутацию рибонуклеиновой кислоты при меланоме (на материале, полученном в результате биопсии). Для этого золотой кантилевер атомно-силового микроскопа модифицировали олигонуклеотидами, которые могут вступать в межмолекулярное взаимодействие с РНК, а силу этого взаимодействия все также можно измерить за счет пьезоэффекта. Чувствительность сенсора АСМ настолько велика, что его уже пытаются применить для изучения эффективности популярного метода редактирования геномов CRISPR-Cas9. Здесь воедино объединяются технологии, созданные разными поколениями исследователей.

Перефразируя классика одной из политических теорий, можно сказать, что мы уже сейчас видим безграничные возможности и неисчерпаемость атомно-силовой микроскопии и вряд ли в силах представить, что ждет нас впереди в связи с дальнейшим развитием этих технологий. Но уже сегодня сканирующий туннельный микроскоп и атомно-силовой микроскоп дают нам возможность увидеть атомы и прикоснуться к ним. Можно сказать, что это не только продолжение наших глаз, позволяющее заглянуть в микрокосм атомов и молекул, но и новые глаза, новые пальцы, способные прикоснуться к этому микрокосму и управлять им.

От фотографии к кинематографу

В 2010 году все тот же Лео Гросс и Райнер Эбел смогли однозначно установить строение природного соединения — цефаландола А, выделенного из бактерии Dermacoccus abyssi (Nature Chemistry, 2010, 2, 821–825, doi: 10.1038/nchem.765). Состав цефаландола А установили ранее с помощью масс-спектрометрии, однако анализ спектров ЯМР этого соединения не давал однозначного ответа на вопрос о его структуре: возможны были четыре варианта. С помощью атомно-силового микроскопа исследователи сразу же исключили две из четырех структур, а из двух оставшихся правильный выбор сделали, сравнив результаты, полученные благодаря АСМ и квантово-химическому моделированию. Задача оказалась непростой: в отличие от пентацена, фуллерена и короненов, в состав цефаландола А входят не только атомы углерода и водорода, кроме того, у этой молекулы нет плоскости симметрии (рис. 5) — но и такую задачу удалось решить.

Еще одно подтверждение того, что атомно-силовой микроскоп можно использовать как аналитический инструмент, получили в группе Оскара Кустанца, в то время работавшего в инженерной школе Университета Осаки. Он показал, как с помощью АСМ различить атомы, отличающиеся друг от друга гораздо меньше, чем углерод и водород (Nature, 2007, 446, 64–67, doi: 10.1038/nature05530). Кустанц исследовал поверхность сплава, состоящего из кремния, олова и свинца с известным содержанием каждого элемента. В результате многочисленных экспериментов он выяснил, что сила, возникающая между острием зонда АСМ и разными атомами, различается (рис. 6). Так, например, самое сильное взаимодействие наблюдалось при зондировании кремния, а самое слабое — при зондировании свинца.

Предполагается, что в дальнейшем результаты атомно-силовой микроскопии для распознавания отдельных атомов будут обрабатываться так же, как результаты ЯМР, — по сравнению относительных величин. Поскольку точный состав иглы датчика трудно контролировать, абсолютное значение силы между датчиком и различными атомами поверхности зависит от условий эксперимента и марки устройства, а вот отношение этих сил при любом составе и форме датчика остается постоянным для каждого химического элемента.

В 2013 году появились первые примеры использования АСМ для получения изображений отдельных молекул до и после химических реакций: создается «фотосет» из продуктов и полупродуктов реакции, который потом можно смонтировать своего рода документальный фильм (Science, 2013, 340, 6139, 1434–1437; ).

Такие результаты дважды удивили исследователей. Во-первых, в ходе реакции образовалось всего лишь два главных продукта. Во-вторых, удивление вызвала их структура. Фишер отмечает, что химическая интуиция и опыт позволяли нарисовать десятки возможных продуктов реакции, однако ни один из них не соответствовал тем соединениям, которые образовывались на поверхности. Возможно, протеканию нетипичных химических процессов способствовало взаимодействие исходных веществ с подложкой.

Естественно, что после первых серьезных успехов в изучении химических связей некоторые исследователи решили применить АСМ для наблюдения более слабых и менее изученных межмолекулярных взаимодействий, в частности водородной связи. Однако в этой области работы еще только начинаются, а результаты их противоречивы. Так, в одних публикациях сообщается, что атомно-силовая микроскопия позволила наблюдать водородную связь (Science, 2013, 342, 6158, 611–614, doi: 10.1126/science.1242603), в других утверждают, что это всего лишь артефакты, обусловленные конструкционными особенностями прибора, а экспериментальные результаты нужно интерпретировать аккуратнее (Physical Review Letters, 2014, 113, 186102, ). Возможно, окончательный ответ на вопрос, можно ли наблюдать водородные и другие межмолекулярные взаимодействия с помощью атомно-силовой микроскопии, будет получен уже в этом десятилетии. Для этого необходимо еще хотя бы в несколько раз повысить разрешение АСМ и научиться получать изображения без помех (Physical Review B, 2014, 90, 085421, ).

Буквы из ксеноновых пикселей

Рассмотреть атомы не всегда было так просто. История атомно-силового микроскопа началась в 1979 году, когда Герд Карл Бинниг и Генрих Рорер, работавшие в Исследовательском центре компании IBM в Цюрихе, приступили к созданию прибора, который позволил бы изучать поверхности с атомным разрешением. Чтобы придумать такое устройство, исследователи решили использовать эффект туннельного перехода — способность электронов преодолевать, казалось бы, непроходимые барьеры. Идея состояла в том, чтобы, измеряя силу туннельного тока, возникающего между сканирующим зондом и изучаемой поверхностью, определять положение атомов в образце.

У Биннига и Рорера получилось, и они вошли в историю как изобретатели сканирующего туннельного микроскопа (СТМ), а в 1986 году получили Нобелевскую премию по физике. Сканирующий туннельный микроскоп совершил настоящую революцию в физике и химии.

В 1990 году Дон Айглер и Эрхард Швайцер, работавшие в исследовательском центре IBM в Калифорнии, показали, что СТМ можно применять не только для наблюдения за атомами, но для манипулирования ими. С помощью зонда сканирующего туннельного микроскопа они создали, возможно, самый популярный образ, символизирующий переход химиков к работе с отдельными атомами — нарисовали на никелевой поверхности три буквы 35 атомами ксенона (рис. 1).

Бинниг не стал почивать на лаврах — в год получения Нобелевской премии совместно с Кристофером Гербером и Кельвином Куэйтом, также работавшими в Цюрихском исследовательском центре IBM он начал работу над еще одним устройством для изучения микромира, лишенного недостатков, которые присущи СТМ. Дело в том, что с помощью сканирующего туннельного микроскопа нельзя было изучать диэлектрические поверхности, а только проводники и полупроводники, да и для анализа последних между ними и зондом микроскопа нужно было создать значительное разрежение. Поняв, что создать новое устройство проще, чем модернизировать существующее, Бинниг, Гербер и Куэйт изобрели атомно-силовой микроскоп, или АСМ. Принцип его работы кардинально иной: для получения информации о поверхности измеряют не силу тока, возникающую между зондом микроскопа и изучаемым образцом, а значение возникающих между ними сил притяжения, то есть слабых нехимических взаимодействий — сил Ван-дер-Ваальса.

Первая рабочая модель АСМ была устроена сравнительно просто. Исследователи перемещали над поверхностью образца алмазный зонд, связанный с гибким микромеханическим датчиком — кантилевером из золотой фольги (между зондом и атомом возникает притяжение, кантилевер гнется в зависимости от силы притяжения и деформирует пьезоэлектрик). Степень изгиба кантилевера определялась с помощью пьезоэлектрических датчиков — сходным образом канавки и гребни виниловой пластинки превращаются в аудиозапись. Конструкция атомно-силового микроскопа позволяла ему детектировать силы притяжения до 10–18 ньютон. Через год после создания рабочего прототипа исследователям удалось получить изображение рельефа поверхности графита с разрешением в 2,5 ангстрема.

За три десятка лет, прошедших с тех пор, АСМ использовали для изучения практически любых химических объектов — от поверхности керамического материала до живых клеток и отдельных молекул, причем находящихся как в статическом, так и динамическом состоянии. Атомно-силовая микроскопия стала рабочей лошадкой химиков и материаловедов, а количество работ, в которых применяется этот метод, постоянно растет (рис. 2).

За эти годы исследователи подобрали условия и для контактного, и для бесконтактного изучения объектов с помощью атомно-силовой микроскопии. Контактный метод описан выше, он основан на вандерваальсовом взаимодействии между кантилевером и поверхностью. При работе в бесконтактном режиме пьезовибратор возбуждает колебания зонда на некоторой частоте (чаще всего резонансной). Сила, действующая со стороны поверхности, приводит к тому, что и амплитуда, и фаза колебаний зонда изменяются. Несмотря на некоторые недостатки бесконтактного метода (в первую очередь чувствительность к внешним шумам), именно он исключает воздействие зонда на исследуемый объект, а значит, интереснее для химиков.