ОСОБЕННОСТИ И ПРЕИМУЩЕСТВА ЛАЗЕРНЫХ МИКРОСКОПОВ

Принципы двухфотонного возбуждения

Явление двухфотонного возбуждения теоретически давно разработано в квантовой оптике. Впервые оно было рассмотрено в докторской диссертации Марии Гепперт-Майер, а экспериментально подтверждено тридцатью годами позже, вскоре после изобретения лазера. Поэтому, очевидно, что у этого явления есть теоретическая база и экспериментальная история. Двухфотонное возбуждение возникает при одновременном поглощении двух фотонов в единичном квантовом событии. Поскольку энергия фотона обратно пропорциональна длине его волны, два поглощенных фотона должны иметь длину волны в два раза большую требуемой при однофотонном возбуждении. Например, флуорофор, обычно поглощающий ультрафиолет (приблизительная длина волны 350 нанометров), может быть возбужден также и двумя фотонами из ближнего инфракрасного диапазона (длина волны приблизительно 700 нанометров), если они одновременно достигли флуорофора (рисунок 1). Одновременность в нашем случае означает интервал около 10•E(-18) секунды.

Поскольку двухфотонное возбуждение зависит от одновременности поглощения, вызываемое флуоресцентное излучение изменяется пропорционально квадрату силы света возбуждения. Эта квадратичная зависимость между возбуждением и испусканием является причиной многих важных преимуществ микроскопии с двухфотонным возбуждением (подробнее обсуждается ниже). Чтобы обеспечить достаточное число двухфотонных поглощений (когда оба фотона взаимодействуют с флуорофором одновременно), плотность фотонов должна быть примерно в миллион раз больше той, которая требуется для того же числа однофотонных поглощений. Следовательно. для генерации достаточной двухфотонно возбуждаемой флуоресценции, необходимы лазеры чрезвычайно высокой мощности. Эта мощность легко достигается с помощью лазера с синхронизованными модами (импульсного лазера), который на пике импульса способен генерировать необходимое число двухфотонных возбуждений, в то время как его средняя лазерная мощность остается достаточно низкой. В этой ситуации, возбужденное в результате поглощения двух фотонов состояние, в котором происходит последующее испускание, является тем же синглетным состоянием, заселяемым во время проведения обычного эксперимента с регистрацией флуоресценции. Таким образом, флуоресцентное испускание, следующее за двухфотонным возбуждением, в точности то же самое, что и испускание, генерируемое обычным однофотонным возбуждением. На рисунке 1 представлена диаграмма Яблонского, иллюстрирующая поглощение единичного (ультрафиолетового) фотона (рисунок 1(a)) одновременное поглощение двух фотонов из ближнего инфракрасного диапазона (рисунок 1(b)), приводящее к идентичному возбужденному состоянию.

Рис. 2. Возбуждение флуорофоров в многофотонной микроскопии

Другой тесно связанный нелинейный оптический процесс, трехфотонное возбуждение, тоже может оказаться полезным в биологических экспериментах. Трехфотонное возбуждение происходит таким же образом, что и двухфотонный процесс, с той лишь разницей, что для генерации испускания с флуророфором одновременно должны взаимодействовать три фотона. По квантово-механическим законам флуоресцентного поглощения, плотность фотонов для трехфотонного возбуждения должна лишь в десять раз превышать плотность, необходимую для двухфотонного возбуждения (а не в миллион раз, как при переходе от одного к двум фотонам). Поэтому в некоторых экспериментах трехфотонное возбуждение может считаться привлекательной дополнительной опцией. Например, инфракрасный лазер (с длиной волны около 1050 нанометров) может генерировать трехфотонное возбуждение поглощающего ультрафиолет флуророфора (на 350 нанометрах) и одновременно — двухфотонное возбуждение флуророфора, поглощающего зеленый свет (на 525 нанометрах). К тому же, трехфотонное возбуждение может применяться для расширения области эффективной визуализации до глубокого ультрафиолета (например, можно использовать 720-нанометровый свет для возбуждения флуророфора, поглощающего в ультрафиолете на 240 нанометрах). Это является существенным усилением возможностей традиционного микроскопа, поскольку ультрафиолетовые длины волн, ниже примерно 300 нанометров, весьма проблематичны для обычной микроскопической оптики. Экспериментально продемонстрированы были и нелинейные эффекты более высокого порядка, такие как четырехфотонное поглощение, хотя вероятность их скорого использования в биологических исследованиях весьма мала.

Двухфотонное возбуждение в лазерной сканирующей микроскопии

Значительные преимущества использования двухфотонного возбуждения в лазерной сканирующей микроскопии проистекают из основного физического принципа, по которому поглощение зависит от квадрата интенсивности света возбуждения. На практике двухфотонное возбуждение достигается фокусированием излучения моноимпульсного лазера через оптику микроскопа. При фокусировании лазерного пучка пространственная плотность фотонов возрастает, а значит, возрастает и вероятность одновременного взаимодействия двух из них с одним и тем же флуорофором. Фокальная точка лазера — единственное место на всем оптическом пути, где плотности фотонов достаточно для генерации ощутимого двухфотонного возбуждения. На рисунке 2 с помощью диаграммы проиллюстрирована генерация двухфотонного возбуждения флуророфора в образце в фокальной плоскости микроскопа. В области выше фокальной точки плотность фотонов недостаточно высока для одновременного прохождения двух фотонов через сечение поглощения одного флуорофора. Однако, в фокальной точке фотоны так близко расположены друг к другу, что два из них могут быть одновременно обнаружены в сечении поглощения одного флуророфора.

На практике двухфотонное возбуждение осуществляется не только пространственной концентрацией фотонов (фокусированием оптикой микроскопа), но и концентрацией их во времени (с помощью импульсов лазера с синхронизацией мод). Комбинация этих способов позволяет достигать необходимых для двухфотонного возбуждения концентраций, но скважность импульсов (отношение длительности импульса на период между импульсами) порядка 10•E(-5) ограничивает среднюю мощность 10 милливаттами, что ненамного больше используемой в конфокальной микроскопии. Хотя длительность лазерного импульса считается ультра короткой, обычно между 100 фемтосекунд и 1 пикосекундой (от 10•E(-13) до 10•E(-12)), она достаточно велика в сравнении со временем поглощения флуорофора (порядка 10•E(-18) секунд).

Высокая степень локализации двухфотонного возбуждения в фокальной точке освещения обуславливает основное преимущество этого метода перед конфокальной микроскопией. В конфокальной микроскопии, хотя флуоресценция и возбуждается во всем объеме, где освещается образец, точечная диафрагма пропускает лишь сигналы из фокальной плоскости, отсекая остальную информацию. И, напротив, при двухфотонном возбуждении флуоресценция генерируется лишь в фокальной плоскости, и поскольку фоновой флуоресценции нет вообще, точечная диафрагма не требуется. Эта существенная разница в характере возбуждения в конфокальной микроскопии и микроскопии с двухфотонным возбуждением может быть продемонстрирована картиной фотообесцвечивания, получаемой каждым из этих методов. На рисунке 3 представлена картина фотообесцвечивания, получающаяся в x-z направлении от повторных сканирований одной x-y плоскости (плоскости изображения) в окрашенной флюоресцеином формваровой пленки. Лазер конфокальной системы возбуждает флуророфоры выше и ниже фокальной плоскости (выделенной белым прямоугольником на рисунке 3(a)), приводя к наблюдаемому обесцвечиванию в обширных областях. Двухфотонное возбуждение, напротив, возникает только в фокальной плоскости, поэтому обесцвечивание ограничено лишь этим участком (рисунок 3(b)).

Рис. 3. Картина фотообесцвечивания, получающаяся в x-z направлении от повторных сканирований одной x-y плоскости

Локализация возбуждения в двухфотонной микроскопии создает множество положительных эффектов. Возможно, самым важным из них является то, что трехмерное разрешение, достигаемое в микроскопии с двухфотонным возбуждением, сопоставимо с тем, которое получается при использовании идеального конфокального микроскопа. К тому же, из-за отсутствия поглощения во внефокусных областях образца, большая часть облучающего света проникает сквозь образец к фокальной плоскости. Следствием этого является значительно большая проницаемость образца, которая обычно в два или три раза выше возможной в конфокальной микроскопии. Другим преимуществом двухфотонного возбуждения (показанным на рисунке 3) является минимизация фотообесцвечивания и фотоповреждения — двух наиболее строгих ограничений во флуоресцентной микроскопии живых клеток и тканей. Хотя механизм повреждения клетки при взаимодействии со светом изучен недостаточно, уменьшение фотоповреждения, несомненно, ведет к повышению жизнеспособности изучаемых биологических образцов. Из опыта можно заключить, что красный возбуждающий свет сам по себе не влияет на жизнеспособность клетки, и, возможно, наиболее сильное фотоповреждение связано с двухфотонным поглощением, а, следовательно, ограничено фокальной плоскостью.

В микроскопии с двухфотонным возбуждением не используется точечная диафрагма для достижения трехмерного разрешения, что создает большую гибкость геометрических параметров схемы детектирования сигнала. Конфигурации определенного и неопределенного детектирования двухфотонного возбуждения представлены на рисунке 4. В определенной конфигурации, испускаемое излучение (изображено синим) возвращается по тому же пути, что и возбуждающий свет, падая на сканирующие зеркала перед тем, как попасть на детектор через конфокальную точечную диафрагму (рисунок 4(а)). В конфокальной микроскопии эта конфигурация применяется для исключения приема внефокусного свечения. Путь неопределенного пучка предполагает больше альтернативных конфигураций: схема с использованием детектора, размещенного в сопряженной плоскости, дихроичное зеркало находится прямо за объективом (рисунок 4(b) и отражает испускаемый свет через линзу переноса на приемник, расположенный в плоскости, сопряженной с задней апертурой объектива; испускаемое излучение может также приниматься внешним детектором непосредственно из образца, без прохождения света через объектив (рисунок 4(c)); либо испускаемый свет может направляться дихроичным отражателем на камеру прибора с зарядовой связью (ПЗС) в промежуточной плоскости изображения с целью получения широкопольного снимка (рисунок 4(d)). Такие конфигурации применяются для систем ускоренного сбора данных, используемых при двухфотонном возбуждении.

Хотя для двухфотонного возбуждения можно использовать схему неопределенного детектирования, для того, чтобы воспользоваться преимуществами глубокого проникновения, рекомендуется применение и неопределенной регистрации сигнала (внешнего детектора). Прием сигнала на неопределенном пути дает возможность собирать больше рассеянных фотонов, не требует большого числа оптических элементов, таких как линзы и зеркала, сокращает длину пути, а вместе с тем и количество пылинок в воздухе на пути флуоресцентного сигнала. Поэтому, использование неопределенного приема при двухфотонном возбуждении значительно увеличивает эффективность детектирования сигналов, и существенно для максимальной глубины проникновения в живую ткань.

Механизмы глубокого сечения

Как уже обсуждалось выше, наиболее важным преимуществом микроскопии с двухфотонным возбуждением является ее способность получать оптические срезы лучшего качества на больших глубинах толстых образцов, чем это возможно другими методами. Поэтому, важно понимать, за счет чего достигается эта увеличенная глубина проникновения. Эффективное проникновение в толстые образцы обеспечивается сочетанием трех физических механизмов:

Отсутствие внефокусного поглощения позволяет возбуждающим фотонам достигать заданной в образце глубины.

Красный и инфракрасный свет, применяемые при двухфотонном возбуждении, подвержены меньшему рассеянию, чем синий свет (более короткие длины волн).

В двухфотонной микроскопии эффекты от рассеяния света сказываются меньше, чем в конфокальной микроскопии.

Хотя эти три механизма и действуют одновременно, имеет смысл рассмотреть их по отдельности. В двухфотонном микроскопе большая доля возбуждающего излучения достигает фокальной плоскости, поскольку вне области концентрации света отсутствуют условия его поглощения, и внефокусное поглощение исключено. В конфокальном же микроскопе фотоны возбуждения поглощаются любыми флуорофорами, встречающимися на пути света возбуждения. Как следствие, меньшее число фотонов достигает фокальной плоскости, что приводит к ослаблению генерируемого сигнала. Этот эффект усиливается, если флуорофоры распределены по всему объему образца, как показано на снимках на рисунке 5. Представленная на этом рисунке полимерная пленка, окрашенная родамином, сама по себе не является рассеивающей, но содержит высокую концентрацию равномерно распределенных флуорофоров.

Верхняя часть x-z снимков на рисунке 5 является ближайшей к объективу, а интенсивность флуоресценции показана как функция глубины сканирования образца (z расстояние) для каждого x-z снимка. Для однофотонного возбуждения (конфокальная микроскопия, рисунок 5(a)) интенсивность стабильно падает с увеличением глубины проникновения, поскольку поглощение света возбуждения растет по мере достижения более глубоких фокальных плоскостей. Разительный контраст наблюдается при двухфотонном поглощении, которое происходит только в фокальной плоскости, поскольку на всем пути прохождения света возбуждения от объектива до фокальной плоскости, свет не поглощается флуорофорами. Таким образом, вся энергия возбуждения достигает фокальной плоскости, что обеспечивает постоянство флуоресцентного сигнала на всей глубине образца (в нашем примере — полимера). Рисунок 5(b) иллюстрирует существенную разницу между конфокальным и двухфотонным возбуждением, при котором интенсивность почти не меняется с глубиной проникновения.

Рис. 4. Конфигурации детектирования сигнала в многофотонной микроскопии

Второй механизм, определяющий эффективность двухфотонного возбуждения при наблюдении толстых образцов, заключается в том, что «более красный» свет возбуждения, применяемый в микроскопии с двухфотонным возбуждением, подвержен меньшему рассеянию в образце, по сравнению с «более синим», применяемым при традиционном возбуждении. Биологические ткани могут считаться неоднородными средами с меняющимися показателями преломления. Свет, проходя через такую среду, многократно рассеивается в различных направлениях. Во флуоресцентной микроскопии возбуждающий свет, падающий на образец, может быть в различной степени рассеян, прежде чем он достигнет фокальной плоскости, а вызываемая им флуоресценция также подвержена рассеянию, проходя обратно сквозь толщу образца к детектору. Оба этих рассеивающих эффекта приводят к ослаблению принимаемого флуоресцентного сигнала.

Из-за неравномерного распределения в биологических образцах веществ с различными свойствами, представляется невозможным точно вычислить или смоделировать характер рассеяния. Тем не менее, рэлеевское рассеяние в первом приближении позволяет минимально оценить долю рассеянного в таких системах света. В нашем примере, количество рассеянного света обратно пропорционально четвертой степени длины волны. Из этого соотношения следует, что 488-нанометровый свет (однофотонный) будет подвержен рассеянию примерно в семь раз большему, чем 800-нанометровый (двухфотонный) свет. Таким образом, эта разница дополнительно способствует увеличению количества света от лазера с двухфотонным возбуждением, достигающего фокальной плоскости, и увеличению глубины проникновения в образец. На практике, наблюдаемое рассеяние от взаимодействия с тканевыми структурами всегда больше рассчитанного по релеевскому закону, но длинные (красные) волны всегда рассеиваются меньше коротких (синих) волн. На стадии приема сигнала во флуоресцентной микроскопии, испускаемая флуоресценция не зависит от способа ее генерации (было ли это одно- или двухфотонное возбуждение), поэтому рассеяние флуоресцентного свечения одинаково влияет на оба метода.

Третий фактор, названный выше, заключается в том, что рассеяние как возбуждающего, так и флуоресцентного света влияет на прием сигнала в двухфотонном методе не так сильно, как в конфокальной микроскопии. Эта разница может быть объяснена с учетом физических процессов формирования изображения в микроскопии с двухфотонным возбуждением. В то время как отсутствие внефокусного поглощения и разница в рассеянии ведут к увеличению доли возбуждающего света, достигающего фокальной плоскости глубоко в неповрежденной ткани, этот третий фактор приводит к увеличению контрастности изображения при двухфотонном возбуждении. Способствующие этому физические аспекты проиллюстрированы на рисунке 6.

Рис. 5. Однофотонные и двухфотонные профили сканирования

В методе двухфотонного возбуждения (см. также рисунок 6), возбуждающие фотоны (красные линии) могут быть рассеяны (g), как и в конфокальной системе. Тем не менее, вероятность рассеяния двух фотонов в одну и ту же точку образца практически нулевая, и следовательно, фоновая вуаль, ухудшающая конфокальное изображение толстых образцов, не возникает при двухфотонном возбуждении. К тому же, большая доля возбуждающего света достигает фокальной плоскости (h и i) благодаря первым двум факторам, о которых говорилось выше: пониженному внефокусному поглощению и меньшему рассеянию длинноволнового света двухфотонного возбуждения. Важно добавить, что существует значительная вероятность того, что генерируемая флуоресценция (зеленые линии), даже при условии ее рассеяния, будет принята фотоумножителем (j), ввиду отсутствия точечной диафрагмы, которая могла бы перекрыть ход лучей(k). Эта нечувствительность к рассеянию и отсутствие внефокусного поглощения позволяют сохранить контрастность изображения на значительной глубине образца.

Рис. 6. Оптические конфигурации

По снимкам, представленным на рисунке 7 (хороидное сплетение акулы, окрашенное флюоресцеином), можно судит о качестве визуализации конфокальной и двухфотонной микроскопии. Эти снимки были сделаны на глубине 80 микрометров ниже поверхности образца, что является максимальной глубиной, на которой еще возможна достаточная для этого образца контрастность при использовании конфокальной микроскопии. Хотя уровень сигнала в самых ярких местах сопоставим при визуализации обоими методами, общая контрастность изображения конфокального снимка (рисунок 7(a)) намного ниже из-за фоновой вуали. И напротив, снимок, полученный двухфотонным возбуждением (рисунок 7(b)), имеет превосходную контрастность. Поскольку в толстых биологических образцах рассеяние флуоресценции становится существенным, применение неопределенной регистрации сигнала, даже при «открытой» точечной диафрагме, недостаточно для использования преимуществ двухфотонного возбуждения.

Разрешение изображения

Разрешение изображения, получаемого при двухфотонном возбуждении, не лучше того, которое достигается хорошо настроенным конфокальным микроскопом. Использование больших длин волн возбуждения (красных или инфракрасных вместо синих или ультрафиолетовых) хотя и является преимуществом двухфотонного возбуждения, в действительности приводит к увеличению порога разрешения. Если биологическую структуру невозможно различить конфокальным микроскопом, то это не удастся и лазерным сканирующим микроскопом с двухфотонным возбуждением. Это хорошо известно опытным в применении этих методик микроскопистам, но начинающие исследователи в биомедицине часто полагают, что преимущества двухфотонного возбуждения включают и более высокое разрешение.

Визуализация толстых образцов

Как говорилось выше, двухфотонное возбуждение более эффективно при визуализации толстых образцов благодаря сочетанию трех факторов: отсутствие внефокусного поглощения приводит к тому, что большая доля возбуждающего света достигает заданной области образца; красный возбуждающий свет рассеивается меньше; рассеяние флуоресценции менее разрушительно для двухфотонной, чем для конфокальной микроскопии. При использовании оптики с большим рабочим расстоянием и конфигурации приема неопределенного сигнала, глубина проникновения и качество изображения часто ограничены возможностью эффективного окрашивания образца. Введение флуоресцентных красителей в ткани тем сложнее, чем глубже исследуемая область. Эксперименты, использующие преимущества экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) в трансгенных животных, похоже, способны повысить эффективность визуализации двухфотонным возбуждением in vivo. Генетически измененные животные открывают широкую перспективу в развитии техники флуоресцентного окрашивания отдельных органов и белков в живых тканях для их последующего наблюдения методом двухфотонного возбуждения. Некоторые характеристики тканей могут накладывать дополнительные ограничения на глубину проникновения при визуализации толстых образцов. Это особенно касается сильно пигментированных тканей, таких как печень, или сильно рассеивающих тканей, таких как кожа.

Визуализация тонких образцов

В общем, при визуализации тонких образцов метод двухфотонного возбуждения не обязательно имеет преимущества перед обычной конфокальной микроскопией. Причина этого в несколько большем фотообесцвечивании, которое может иметь место в фокальной плоскости (хотя суммарное фотообесцвечивание толстых образцов намного меньше в сравнении с традиционными методиками, как показано на рисунке 3). Тем не менее, существуют приложения, для которых применение двухфотонного возбуждения целесообразней даже для тонких образцов; примером может служить визуализация возбуждаемых ультрафиолетом флуорофоров, таких как NADH (обсуждается ниже). В таких экспериментах вред, наносимый ультрафиолетом, более губителен, чем вызываемое двухфотонным возбуждением фотообесцвечивание. Оценивая потенциальные преимущества двухфотонного возбуждения, стоит сначала провести наблюдения на конфокальном микроскопе. Зная ограничения, накладываемые на изображение, конфокальным методом, легче определить целесообразность применения в данном эксперименте метода двухфотонного возбуждения.

Спектр поглощения

В общем, спектры двухфотонного поглощения имеют мало сходства с соответствующими однофотонными спектрами. Накопленный к настоящему времени опыт указывает на то, что флуророфоры достаточно хорошо реагируют на двухфотонное возбуждение на длине волны в два раза большей той, на которой достигается пик поглощения флуророфора при однофотонном возбуждении. По физико-химическим причинам, лежащим вне рамок нашего обсуждения, флуорофоры с несимметричной химической структурой более склонны к этому взаимодействию, чем симметричные. Например, флуоресцентные белки (CFP, GFP, YFP и другие) характеризуются несимметричными флуорофорами и поглощают строго на длине волны, в два раза большей той, которая требуется при однофотонном возбуждении. Но для использования всех возможностей микроскопии с двухфотонным возбуждением, тем не менее, необходимо измерять спектры поглощения флуорофоров. Технически это значительно трудней, чем измерение обычного спектра однофотонного поглощения, и информации на этот счет совершенно недостаточно. Но поскольку применение этой методики растет, спектры двухфотонного поглощения, вероятно, станут более доступными для широких кругов.

Конфигурация конфокального микроскопа Olympus FV3000 с лазерным сканированием

Основные характеристики оптической системы микроскопа в течение многих десятилетий оставались в основном неизменными из-за технических ограничений на объективный дизайн, статических свойств большинства образцов и того факта, что разрешение определяется длиной волны света. Однако флуоресцентные зонды, которые используются для добавления контраста к биологическим образцам и другим технологиям, связанным с методами оптической микроскопии, значительно улучшились. Взрывной рост и развитие конфокального подхода является прямым результатом возрождения в оптической микроскопии, чему в значительной степени способствовали достижения в современной оптической и электронной технике. Среди них — стабильные многоволновые лазерные системы, которые обеспечивают лучшее покрытие ультрафиолетовой, видимой и ближней инфракрасной областей спектра, улучшенные интерференционные фильтры (включая дихроматические зеркала, барьерные фильтры и фильтры возбуждения), чувствительные малошумящие широкополосные детекторы и гораздо более мощные компьютеры. Последние теперь доступны с относительно дешевыми массивами памяти, пакетами программного обеспечения для анализа изображений, видеодисплеями с высоким разрешением и высококачественными цифровыми принтерами изображений. Поток информации через современный конфокальный микроскоп схематически представлен на рисунке 5.

Хотя многие из этих технологий были разработаны независимо для различных целевых приложений, они постепенно были включены в основные коммерческие системы конфокальной микроскопии. В современных микроскопических системах классификация образцов основана на технологии, используемой для сканирования образцов. Сканирование может быть выполнено либо путем перемещения ступени в направлениях x, y и z, когда пятно лазерного освещения удерживается в фиксированном положении, либо сам луч может сканироваться растром по всему образцу. Поскольку трехмерная трансляция сцены громоздка и подвержена вибрации, большинство современных инструментов используют какой-либо механизм сканирования луча.

В современных конфокальных микроскопах были разработаны два принципиально различных метода сканирования луча. Однолучевое сканирование, один из наиболее популярных методов, используемых в большинстве коммерческих лазерных сканирующих микроскопов, использует пару управляемых компьютером зеркал гальванометра для сканирования образца в растровом режиме со скоростью примерно один кадр в секунду. Более высокая скорость сканирования (почти до скорости видео) может быть достигнута с помощью акустооптических устройств или колеблющихся зеркал. Напротив, многолучевые сканирующие конфокальные микроскопы оснащены вращающимся диском Нипкова, содержащим массив точечных отверстий и микролинз. Эти приборы часто используют дуговые разрядные лампы для освещения вместо лазеров, чтобы уменьшить повреждение образца и улучшить обнаружение низких уровней флуоресценции во время сбора изображений в реальном времени. Другой важной особенностью многолучевых микроскопов является их способность легко захватывать изображения с помощью матричного детектора, такого как система камер с зарядовой связью (CCD).

Все конструкции конфокальных микроскопов с лазерным сканированием сосредоточены вокруг обычного вертикального или инвертированного оптического микроскопа исследовательского уровня. Однако вместо стандартной вольфрам-галогенной или ртутной дуговой разрядной лампы одна или несколько лазерных систем используются в качестве источника света для возбуждения флуорофоров в образце. Информация об изображении собирается точка за точкой с помощью специализированного детектора, такого как фотоумножитель или лавинный фотодиод, а затем оцифровывается для обработки главным компьютером, который также управляет сканирующими зеркалами и / или другими устройствами для облегчения сбора и отображения изображений. После того, как серия изображений (обычно последовательные оптические срезы) была получена и сохранена на цифровом носителе, анализ может быть выполнен с использованием многочисленных пакетов программного обеспечения для обработки изображений, доступных на главном или вспомогательном компьютере.

Сфера применения конфокального микроскопа

Роль конфокальной микроскопии среди нашего населения достаточно велика. Но если говорить об основных ее задачах, то всех их можно выделить в три основные группы: структурное изучение клеток, взаиморасположение в структуре клетки различных веществ, изучение всех процессов, происходящих в ней. Как было уже сказано выше, именно за счет разрешения высокого уровня микроскопов, а также благодаря возможности осуществить серию срезов клетки, можно провести трехмерное исследование клетки. Благодаря технологиям развития и компьютерным технологиям, с помощью них удается посмотреть любой изучаемый объект в трехмерном измерении, так называемое изображение 3D, а также исследовать клетку под разными углами. Такое свойство и особенность конфокальных микроскопов позволяют детально изучить форму клетки, ее скелет, ядро, его структуру, строение и структуру хромосом с изучением отдельных генов.

Основными направлениями развития конфокальной микроскопии являются следующие:

В развитии области фармакологии и диагностической медицины конфокальный микроскоп сыграл особую роль. Следует отметить, что применение конфокального микроскопа в вышеуказанной сфере деятельности сегодня позволяет:

Исторический очерк

Основная концепция конфокальной микроскопии была первоначально разработана Марвином Мински в середине 1950-х годов (запатентовано в 1957 году), когда он учился в докторантуре Гарвардского университета. Минский хотел изобразить нейронные сети в неокрашенных препаратах мозговой ткани и руководствовался желанием изобразить биологические события, происходящие в живых системах. Изобретение Мински осталось в значительной степени незамеченным, скорее всего, из-за отсутствия источников интенсивного света, необходимых для получения изображений, и компьютерной мощности, необходимой для обработки больших объемов данных. После работы Минского М. Дэвид Эггер и Моймир Петран в конце 1960-х годов изготовили многолучевой конфокальный микроскоп, который использовал вращающийся (Nipkow) диск для исследования неокрашенных срезов мозга и ганглиозных клеток. Продолжая работать в этой области, Эггер продолжил разработку первого механически сканированного конфокального лазерного микроскопа и опубликовал первые узнаваемые изображения клеток в 1973 году. В конце 1970-х и 1980-х годах были достигнуты успехи в области компьютерных и лазерных технологий в сочетании с новыми алгоритмами для цифрового манипуляции с изображениями привели к растущему интересу к конфокальной микроскопии.

К счастью, вскоре после истечения срока действия патента Мински несколько исследователей превратили практические конструкции конфокального микроскопа с лазерным сканированием в рабочие инструменты. Голландский физик Г. Фред Бракенхофф разработал сканирующий конфокальный микроскоп в 1979 году, в то время как почти одновременно Колин Шеппард внес свой вклад в эту технику с помощью теории формирования изображений. Тони Уилсон, Брэд Амос и Джон Уайт разработали эту концепцию и позже (в конце 1980-х) продемонстрировали полезность конфокальной визуализации при исследовании флуоресцентных биологических образцов. Первые коммерческие приборы появились в 1987 году. В 1990-х годах достижения в области оптики и электроники позволили получить более стабильные и мощные лазеры, высокоэффективные сканирующие зеркальные блоки, высокопроизводительную волоконную оптику, улучшенные тонкопленочные диэлектрические покрытия и детекторы с пониженными шумовыми характеристиками. Кроме того, начали синтезироваться флуорохромы, которые были более тщательно подобраны к линиям лазерного возбуждения. В сочетании с быстро растущей скоростью компьютерной обработки, улучшенными дисплеями и технологией хранения больших объемов, появившейся в конце 1990-х годов, была подготовлена почва для виртуального взрыва числа приложений, на которые можно было ориентироваться с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.

Современные конфокальные микроскопы можно рассматривать как полностью интегрированные электронные системы, в которых оптический микроскоп играет центральную роль в конфигурации, состоящей из одного или нескольких электронных детекторов, компьютера (для отображения, обработки, вывода и хранения изображений) и нескольких лазерных систем. в сочетании с устройствами выбора длины волны и блоком сканирования луча. В большинстве случаев интеграция между различными компонентами настолько тщательна, что весь конфокальный микроскоп часто все вместе называют цифровой или видеосистемой, способной создавать электронные изображения. Эти микроскопы в настоящее время используются для рутинных исследований молекул, клеток и живых тканей, которые были невозможны всего несколько лет назад.

Принцип работы и особенности конструкции оптического микроскопа

Оптический микроскоп имеет такие составляющие: штатив микроскопа, который также включает в себя предметный столик, осветительная система данного прибора, а также система, предназначенная для построения изображения исследуемого объекта.

Источник света

Осветительная система микроскопа должна быть устроена так, чтобы удовлетворять совершенно два разносторонних требования: первое – это то, что осветительная система должна обеспечить полное и равномерное освещения всех частей изучаемого поля и объекта, а второе – это световой поток должен быть сфокусирован на определенной точке изучаемого объекта, чтобы были прекрасные условия не только для рассмотрения и визуализации объекта и но и для произведения фотоснимков.

Также обязательным требованием к осветительной системе микроскопа является подача довольно яркого света. В более дешевых моделях такой техники роль такого источника играет нагреваемая углеродная нить. Более дорогие варианты такого оборудования оснащены ксеноновыми трубками.

Для того, чтобы обеспечить необходимую яркость освещения исследуемого объекта используется так называемый конденсор – важный элемент осветительной системы микроскопа. Для достижения данной цели изображение источника располагают довольно близко к задней фокальной плоскости, тем самым добиваются освещения образца параллельными пучками. Апертурная диафрагма, в свою очередь, обеспечивает ограниченное освещение, которое поступает от осветителя непосредственно на изучаемый объект.

Если закрыть эту диафрагму, то можно добиться повышения уровня контрастности. Контрастность увеличивается, но, одновременно, снижается яркость освещения объекта.

Полевая диафрагма располагается в плоскости изображения объектива. Она предназначена для того, чтобы снизить световое отражение.

Выбор размера диафрагмы зависит напрямую от размеров того объекта, который будет подлежать изучению.

В настоящее время конструкции микроскопов весьма мобильны и вариабельны, что позволяет изменить положение осветительной части прибора и с легкостью его превратить в микроскоп проходящего света, что позволит изучать тонкие объекты в различный сферах деятельности, как в медицине, биологии, так и в промышленности, металлургии и других.

Предметный столик

Ко всем элементам микроскопа предъявляются те либо иные требования. Что касается штатива и предметного столика микроскопа, то он должен быть весьма устойчив. Должна адекватно обеспечиваться стабильность положения изучаемого образца. Однако, важна стабильность положения не только относительно горизонтально оси, но и вертикальной. Именно стабильность образца для исследований обеспечивает штатив и расположенный на нем предметный столик.

Юстировка приборов для микроскопических исследований проводиться относительно всех координат, которых всего насчитывается три. При этом механическая свобода должна быть сведена к минимуму.

Оптическая схема микроскопа включает объектив и окуляр

Объектив является наиболее важной частью системы многократного увеличения объектов. В настоящее время есть огромный выбор самых различных оптических систем, которые могут удовлетворить самые различные требования: от минимальных нужд, которые требуются для школьного микроскопа, заканчивая научно-исследовательскими моделями.

Одними из наиболее важных характеристик объективов является, естественно, его увеличение, а также числовая апертура. Соответствующие оптические характеристики микроскопа всегда находятся на объективе. В современных объективах линзы являются ахроматизированными.

Каждая разновидности объективов для микроскопов выполнена в соответствии с поставленными к ним требованиями.

Для изучения гистологической структуры тканей производится тончайший срез, который как-то должен быть защищен от влияния на него внешних воздействий. Именно для этого на стекло, на которое помещен образец, накладывается так называемое покровное стекло, имеющее минимальную толщину. Объективы, которые предназначены для изучения гистологических препаратов, сконструированы так, чтобы учесть тот самый коэффициент преломления и толщину стекла, покрывающего объект.

Что такое окуляр?

Окуляр также является важной частью оптической системы микроскопа, при помощи которой происходит непосредственный контакт глаза исследователя и увеличивающей аппаратуры. Именно окуляр позволяет глазу человека визуализировать то изображение, которое формируется объективом аппарата. Однако, окуляр в современном мире технологий может быть без проблем заменен некоторыми цифровыми элементами, такими, как, например, фото- либо видеокамера.

Построение изображения в микроскопе

В некоторых случаях одной возможности увеличения самого объектива оказывается недостаточно для визуализации мелких нюансов исследуемых объектов. Это не является неразрешимой проблемой, так как есть несколько способов, которые позволяют получить большие цифры увеличения объекта.