ПОЛЯРИЗАЦИОННЫЙ КОНТРАСТ

Метод светлого поля

Этот метод подходит для исследования прозрачных препаратов, которые содержат непрозрачные объекты, либо в них присутствуют структурные участки с разным коэффициентом преломления. Например, тонкие срезы биотканей или окрашенные шлифы минералов.

Световой пучок, образованный осветителем микроскопа, проходит сквозь образец препарата и объектив. В плоскости изображения образуется равномерно освещённое поле. Непрозрачные частицы, содержащиеся в препарате, отражают либо частично поглощают свет, образуя лучи разного уровня интенсивности. Это способствует проявлению изображения.

Метод также используется при изучении непоглощающих объектов. Но только тех, которые способны рассеивать пучок света так, чтобы основная его часть оставалась за пределами объектива.

Рис. 1 Принцип освещения по Кѐллеру. 1 – источник света, 1а – изображение источника света, 2 – коллектор, 3 – полевая диафрагма осветителя, 3а – изображение полевой диафрагмы, 4 – светофильтр, 5 – апертурная диафрагма, 6 – конденсор, 7 – препарат, 8 – объектив микроскопа

Метод тёмного поля

Суть темнопольной микроскопии заключается в способности некоторых микроорганизмов к интенсивному рассеиванию света. Метод подходит для получения изображений живых и неокрашенных образцов, например, одноклеточных водных организмов.

Для исследования используются стандартные объективы и особые темнопольные конденсоры. Особенность вторых в том, что их центральная область затемнена. Что исключает попадание в объектив микроскопа прямых лучей осветителя. На образец направлены только боковые лучи, за счёт чего в объективе можно наблюдать только лучи, рассеянные исследуемыми частицами. Метод базируется на эффекте Тиндаля, пример которого — видимость частиц пыли в воздухе при освещении конусообразным солнечным лучом.

Во избежание попадания в объектив прямых лучей осветителя, действующее отверстие объектива (апертура) должно быть меньшего диаметра, чем у конденсора. Для его уменьшения внутрь стандартного объектива устанавливают диафрагму либо применяют специальные оптические приборы с ирисовой диафрагмой.

Применение метода тёмного поля позволяет добиться яркого свечения микроорганизмов на чёрном фоне, за счёт чего можно обнаружить даже самые мельчайшие частицы, чьи размеры выходят за пределы разрешающей способности микроскопа. Но в этом случае можно наблюдать лишь контуры объектов, без возможности изучения их внутренней структуры.

Для изучения препаратов необходимы предметные стёкла толщиной не более 1,2 мм, не имеющие загрязнений или повреждений. Также следует не допускать наличия в образце пузырьков воздуха, крупных частиц. Необходим мощный осветитель, с максимальным накалом лампы. Настройка осуществляется в несколько этапов:

После этих этапов необходимо установить объектив нужного увеличения и приступать к исследованию образца.

Рис. 2 Освещение препарата в методе темного поля в отражённом свете

Фазовый контраст

При изучении неокрашенных объектов, которые отличаются от окружающей среды только показателем преломления, интенсивность света не меняется. Меняется лишь фаза световых волн. Такие изменения абсолютно незаметны в светлом поле, поскольку микроорганизмы прозрачны и не имеют цвета.

Для исследования таких объектов подходит именно фазово-контрастная микроскопия. Её суть — трансформация фазовых изменений световой волны в амплитудные, видимые глазу.

Рис. 3 Фазовые пластинки

Оборудование для фазового контраста можно установить на любой световой микроскоп. Оно состоит из:

Рис. 4 Устройство фазового контраста

Настройка включает следующие этапы:

После этого вспомогательный телескоп необходимо настроить с помощью винтов регулировки. Затем телескоп снова заменить окуляром.

Применение этого метода позволяет добиться увеличения контрастности живых неокрашенных микроорганизмов на светлом или тёмном фоне. Таким способом исследуют клетки, вирусы, минеральные и органические компоненты.

Рис. 5. Клетка в фазовом контрасте

Поляризационный контраст

Поляризация применяется для исследования анизотропных объектов, обладающих двойным лучепреломлением или отражением. Это могут быть минералы, угли, кристаллы, шлаки, ткани и клетки, волокна.

Рис. 6: А — источник света. В – неполяризованный свет. С – поляризационная решётка. D –поляризованный свет

Суть метода — наблюдение образцов в свете, созданном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях. Для этого в стандартный микроскоп устанавливают два дополнительных фильтра — поляризатор и анализатор, которые расположены параллельно друг к другу. Поэтому при исследовании в тёмном поле зрения прибора можно наблюдать тёмные, светлые либо окрашенные анизотропные элементы. Их вид зависит от положения объекта относительно плоскости поляризации. Повысить точность получаемых оптических данных можно при помощи компенсаторов — клиньев и пластинок.

Рис. 7 Двойное лучепреломление

Рис. 8 Оптическая ось кристалла

Хоффмановский контраст

Хоффмановский контраст (ХК) — это метод косого освещения, при котором за счёт градиентности оптических фаз повышается контраст в окрашенных и неокрашенных препаратах. С его помощью можно получать трёхмерное высокоточное изображение живых образцов, что открывает большие возможности для различных научных и медицинских исследований. Большое рабочее расстояние с применением высоких числовых апертур обеспечивает точное отслеживание движения объектов.

Другие виды исследований (электрофизиология, ЭКО) требуют использования не только конденсоров, но и объективов с большим рабочим расстоянием. Хоффмановский контраст позволяет проводить послойное изучение толстых образцов, выбирая последовательность фокальных планов.

Метод может применяться на микроскопах с флуоресцентными осветителями. Исследование морфологии с применением флуоресценции или без возможно без замены образца и объективов. По сравнению с фазовым контрастом, при Хоффмановском контрасте не возникает эффект Гало — вторичное свечение по контуру изображения, мешающее получать полную информацию об объекте.

Рис. 9 Биологическое оборудование для исследования прозрачных объектов

Флуоресценция (люминесценция)

Некоторые невидимые при обычном свете вещества обладают способностью к люминесценции, то есть могут светиться, поглощая энергию источника. Именно на этом основана флуоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Поглощая фотоны света, образец излучает свет другой, более длинной волны фотолюминесценции (правило Стокса).

Люминесценцию провоцируют при помощи ультрафиолетового излучения либо специальных красителей. Исследование проводится с помощью специального флуоресцентного микроскопа. Его особенности:

Для проявления люминесценции образцы освещают через объектив. Важную роль здесь выполняет специальная интерференционная светоделительная пластинка. Это полупрозрачное стекло, которое выборочно отражает и направляет в объектив долю спектра, провоцирующего люминесценцию, пропуская её свет в окуляр.
Оптическую систему флуоресцентного микроскопа изготавливают из специальных сортов оптического стекла, не подверженных люминесценции, склеивая их нелюминесцирующим клеем.

У большей части исследуемых частиц отсутствует собственная люминесценция, поэтому для наблюдения за ними применяются специальные способы обработки. Например, флуорохромирование — окрашивание частиц сильно разбавленными флуоресцирующими красителями.

В сравнении с обычной, флуоресцентная микроскопия открывает более широкие возможности для изучения различных клеток, их микроструктуры, функциональных и морфологических изменений.

Рис. 10 Флуоресцентный микроскоп — оптический прибор, показывающий в увеличенном виде клетки

Дифференциально-интерференционный контраст

Дифференциально-интерференционный контраст (ДИК) — это усовершенствованный (в сравнении с поляризационным) метод получения контраста в прозрачных образцах. Для этого исследования используют микроскоп с лучепреломляющей призмой Номарского. Она расщепляет поляризованный луч на два световых пучка, которые проходят через образец оптическими путями разной длины.

Рис. 11 Виды поляризации. Поляризация описывается фигурами Лиссажу и соответствует сложению поперечных колебаний равной частоты

Применение этого метода позволяет получать монохромное изображение, отображающее градиент высокопространственных и низкопространственных частот, содержащихся в образце. Участки образца, в которых длина оптических путей возрастает по отношению к контрольному пучку, становятся ярче или более тёмными. Участки с меньшими различиями демонстрируют обратный контраст. Чем выше градиент оптических пучков, тем более контрастным получается изображение.

Рис. 12 Схема ДИК микроскопии в проходящем свете

Человеческий глаз может различать объекты, если они отличаются от фона яркостью, цветом, насыщенностью, удалённостью и тому подобным. Оптический контраст прямо пропорционален разности яркости объекта наблюдения и фона, и обратно пропорционален яркости объекта наблюдения: K (контрастность) = (B1-B2)/B1. Для контрастирования могут использоваться различные фильтры, пластинки с прорезями, линзы и зеркала, устанавливающиеся в оптическом канале. Эти элементы: отсекают определённую область спектра электромагнитного излучения, задерживают ход лучей, изменяют угол падения светового пучка, собирают или рассеивают лучи света.

Светлое поле – это метод освещения конусом света, который преломляется, отражается и рассеивается от образца, формируя изображение. Пройдя через образец или отразившись от него, свет проходит через объектив, тубусную призму, линзы окуляров/c-mount адаптеров и регистрируется камерой или глазами. Нюансов не много: как минимум, нужно достаточно света, чтобы отчётливо увидеть объект и нужен конденсор, для равномерного распределения света в поле зрения. Если другие методы контрастирования не требуются, то используйте Olympus CX23, CX33 и Hund MedPrax. При светлом поле важное значение имеет именно центровка освещения, настройка «освещение по Кёллеру». При таком освещении, свет попадает в отверстие апертурной диафрагмы конденсора, ограничивающей размер пучка света. Регулируя диаметр апертурной диафрагмы можно изменять максимальный угол конуса освещения образца, а полевой диафрагмой можем регулировать размер освещаемой площади.

Рис. 1. Принцип освещения по Кѐллеру. 1 – источник света, 1а – изображение источника света, 2 – коллектор, 3 – полевая диафрагма осветителя, 3а – изображение полевой диафрагмы, 4 – светофильтр, 5 – апертурная диафрагма, 6 – конденсор, 7 – препарат, 8 – объектив микроскопа

Тёмное поле – это метод контрастирования, при котором образец освещается полым конусом света, который рассеивается от образца и формирует изображение. Метод был разработан Р. Зигмонди и Р. Зидентопфом в 1903 году и подходит только для объектов минимально отражающими и поглощающими свет, то есть, предназначен для микроскопирования прозрачных объектов.

Рис. 2. Освещение препарата в методе темного поля в отражённом свете.

Темнопольные объективы (рисунок 2, слева) для исследований в отражённом свете кардинально отличаются от светлопольных: от осветителя свет проходит через диафрагму (это исключает засветку по центру) по каналам в стенке объектива и падают на образец по касательной под таким углом, чтобы рассеиваться от неровностей и не попадать в оптический канал объектива. То есть ровную поверхность мы не видим (так как она не рассеивает свет) – это тёмная область в поле зрения, а все неровности – светлые. Для этого метода исследования используются темнопольные микроскопы Olympus BX43 и BX53M.

Из особенностей этого метода надо отметить, что, если у объективов будет слишком высокая апертура, а значит и большой угол конуса раскрытия света, то часть света не рассеется от образца, а отразится от поверхности и попадёт в объектив. Для того, чтобы этого избежать, в темнопольных объективах установлена ирисовая диафрагма, которую вы можете видеть, например, в объективах с большим увеличением UPLFLN100XOI2/1.3.

Рис. 3. Трепонема в тёмном поле.

Фазовый контраст – это метод преобразования сдвига фаз в изменения амплитуды световой волны, то есть, яркости. Фазовые изменения, которые зависят от толщины, состава, геометрии и т.д. возникают из-за различных показателей преломления в прозрачных объектах, а, следовательно, разности ходов лучей.

Рис. 4. Клетка в фазовом контрасте.

Метод фазового контраста был разработан в 1934 году Ф. Цернике, который через 19 лет получил мировое признание и стал лауреатом Нобелевской премии в области физики. С помощью этого метода впервые стало возможно наблюдать структуру неокрашенных клеток. Диаметр клетки без ядра может быть меньше 1 мкм и не обладать свойствами поглощения видимой области светового спектра, что затрудняет её наблюдения по методам светлого и тёмного поля.

Рис. 5. Устройство фазового контраста.

Фазовый контраст основан на том, что сдвиг фазы лучей, проходящих через биологические объекты, примерно равен (90°). Чтобы понять область применения метода, объясним, как он работает.

Когда световые волны проходят через среду, отличную от вакуума, взаимодействие со средой приводит к изменению амплитуды и фазы волны в зависимости от свойств среды. Изменения амплитуды (яркости) возникают из-за рассеяния и поглощения света, который часто зависит от длины волны и может приводить к появлению цветов.

Обратите внимание на график, есть две оси: амплитуда и время. Нам сейчас интересно смещение волн по оси времени, без изменения фазы. Проходя через клетки, фаза смещается, примерно, на четверть от первоначальной длины волны. Теперь посмотрите на рисунок 5. Проходя через кольцевую диафрагму, свет падает полым конусом на объект, проходит через него, разделяется на два луча: один луч (полая воронка света, фоновый свет) попадает в объектив, не преломляясь от клетки и проходит через фазовую пластинку, на которой, в канавке между центром и краем, нанесен специальный материал, задерживающий свет на -90° (тогда это отрицательный фазовый контраст) либо наоборот сдвигающий на +90° (положительный фазовый контраст); второй луч преломляется, рассеивается (становится дифрагированным) в фазовом объекте (клетки, маленькие кристаллы и т.д.) и тоже приобретает сдвиг по фазе.

Рис. 6. Фазовые пластинки.

Фоновый свет, пройдя через канавку в фазовом кольце, распределится более-менее равномерно во всём поле зрения и произойдёт интерференция когерентного света (ведь свет, замедленный при прохождении через клетку, находится в той же фазе). Таким образом Вы видите увеличение амплитуды там, где фоновый свет, накладывается на дифрагированный.

Такой метод подойдёт только для тонких объектов, потому что длина волны видимого света мала, и чтобы хорошо видеть сдвиг, необходимо, чтобы объект смещал его примерно на 90°. Через напыление в канавке фазового кольцо проходят не только фоновые волны, но и дифрагированные волны смещаются по фазе, однако они не интерферируют и не искажают картину.

Качественный фазовый контраст легко настроить на микроскопах Olympus CX43, BX53, CKX53 и IX53. Настраивая фазовый контраст, необходимо совместить кольцо света, прошедшего через фазовую пластинку конденсора, с фазовым кольцом объектива.

Поляризационный контраст – это оптический метод обнаружения, определения свойств и строения анизотропных объектов по характеру их двулучепреломления и цвету.

Явление поляризации света при отражении открыл Этьен Луи Малюс в 1808 году, а двумя годами позже предложил метод определения оптической оси кристалла. Не менее важный вклад внёс Дэвид брюстер, открыв 1815 двулучепреломление в средах с искусственной анизотропии и круговую поляризацию.

Открытие поляризации дало возможность исследователям наблюдать поведение света при прохождении через кристаллы. Например, если просматривать текст через исландский шпат CaCO3, то вы увидите, как текст двоится (см. рисунок 7).

Рис. 7. Двойное лучепреломление.

Рис. 8. Оптическая ось кристалла.

Так как, разные кристаллы «раздваивают» свет по-разному, их можно классифицировать по светопреломлению. Обратите внимание на рисунок №8. Падающий пучок разделяется на обыкновенный и необыкновенный лучи. Буквенные обозначения ne и no – это показатели преломления необыкновенного луча и обыкновенного – соответственно. Ниже приведём таблицу этих показателей.

Чтобы отсечь фоновый свет, который состоит из множества электромагнитных волн, колеблющихся в разных плоскостях и направлениях, необходимо использовать поляризаторы, поляроиды или поляризационные решётки. Щели в поляризационных решётках на столько малы, что через них проходят электромагнитные волны, лежащие в одной плоскости, как показано на рисунке 9. Такой поляризованный свет, пройдя через лучепреломляющий материал, разложится на два луча. Непреломлённый луч, двигающийся в той же плоскости будет отсечён другой решёткой, повёрнутой на 90º, по отношению к первой решётке. В итоге, если исследуемый образец находится между двумя скрещенными поляризационными решётками, поляризаторами или поляроидами, то на выходе будет виден только преломлённый свет.

Рис. 9. А — источник света. В – неполяризованный свет. С – поляризационная решётка. D –поляризованный свет.

В поляризационном микроскопе можно увидеть не только двулучепреломление, но и дихроизм (свойства некоторых кристаллов поглощать больше одни волны одной длины, чем другой), фотоупругость (изменение цвета анизотропных участков в изотропных средах, под действием механических напряжений), отследить вращение плоскости поляризации, а также интерференцию поляризационных лучей. В некоторых кристаллах (кварц, киноварь), чистых растворах (скипидар) и газах, наблюдается вращение плоскости поляризации. При этом происходит изменение интенсивности света, это связано с поворотом электрического вектора световой волны. В чистых веществах, по изменению интенсивности света при вращении плоскости поляризации, судят о толщине слоя вещества, концентрации оптически активных частиц и других характеристиках.

Рис. 10. Фотоупругость.

Интерференцию поляризованных лучей в кристалле используют в кристаллооптике для определения структуры и ориентации осей кристалла, а в минералогии для определения минералов и горных пород, для обнаружения напряжений и деформаций в твёрдых телах. Во многих кристаллографических лабораториях и бюро СМЭ, используются поляризационные микроскопы Olympus BX53P и Hund H600POL.

Стоит заметить, что поляризационные фильтры используют и для снижения бликов и засветов, потому что из всех электромагнитных волн, колеблющихся в разных плоскостях, остаются только те, которые колеблются в плоскости поляризатора и не интерферируют между собой.

Дифференциально-интерференционный контраст – это метод изучения преломляющей способности анизотропных сред по интерференции поляризованных лучей, проходящих через них.

Рис. 11. Виды поляризации. Поляризация описывается фигурами Лиссажу и соответствует сложению поперечных колебаний равной частоты

В отличии от ранее рассмотренного поляризационного контраста, при ДИК микроскопии, между поляризатором и анализатором устанавливается призма Номарского, которая разделяет свет на два отдельных световых луча с ортогональной плоскостью поляризации. Эти два световых луча проходят вблизи друг друга через образец. Поскольку они испытывают различное преломление или рассеяние в образце, происходят разные фазовые сдвиги. Пройдя через образец лучи соединяются и преобразуются в эллиптически поляризованные лучи. Обратите внимание на рисунок 11, красным и зелёным цветом показаны магнитное и электрическое поля. Если их фазы совпадают, то свет линейно-поляризован, но если они движутся в разных фазах, то колебания света (голубая линия) приобретают эллиптический вид.

Преобразуется эллиптически поляризованный свет в амплитудный сдвиг волны, с помощью анализатора. Таким образом, можно сделать видимыми фазовые сдвиги разностей длин волн до 1/200 длины волны (или даже 1/1000 длины волны с использованием камеры) и всей длины волны.

Рис. 12. Amoeba Proteus. Слева ДИК, справа – светлое поле.

Рис. 13. Схема ДИК микроскопии в проходящем свете.

Дифференциально-интерференционный контраст по пунктам:

Для дифференциально-интерференционного контраста микроскопии требуется просветлённая оптика с максимальной пропускной способностью и без напряжений, то есть Планфлуорит, которой комплектуются Olympus BX63 и BX53M.

Рис. 14. Формирование изображения при дифференциально-интерференционном контрасте.

Перейти на страницу с микроскопами в нашем каталоге

Какой метод наблюдения будет использоваться? Нужна ли методика повышения контраста?

Эта статья — четвертая из цикла «Выбор объективов для микроскопа». Ссылки на первую, вторую и третью части.

Не все объекты можно с одинаковых успехом рассмотреть в светлом поле. Если Вы имеете дело с толстыми образцами, слишком тонкими, прозрачными, двулучепреломляющими и т.п., то необходимо применение определённой методики контрастирования. Это тёмное поле, флуоресценция, дифференциальный интерференционный контраст (ДИК), фазовый контраст, поляризация, а также вариации этих методик (см. рис. 8). Эти методы используются повсеместно как в проходящем (кроме флуоресценции), так и в отражённом свете (кроме фазового контраста). Объективы для осуществления каждой из методик проектируются специальным образом, а информацию о методе контрастирования можно найти на самом объективе. В тёмном поле будут видны тонкие прозрачные структуры (в проходящем свете), фазовый контраст используется для выделения тонких неокрашенных предметов с различными показателями преломления. Соответствующий объектив для ФК можно распознать по наличию надписи «Ph» зелёного цвета с числом (1, 2 или 3, в зависимости от размера фазового кольца внутри). Д ИК обозначается как DIC, а поляризационные объективы имеют всю маркировку красного цвета и надпись «Pol». Подробнее о методах контрастирования читайте в нашей статье.

Рисунок 8 – Представление различных образцов в основных методиках контрастирования

В какой среде находится образец?

Большинство объективов проектируется для работы в воздушной среде, что подразумевает наличие воздушной прослойки между образцом и фронтальной линзой объектива. Но многие создаются также и для работы в иммерсионной среде, так что имеют повышенный показатель преломления, позволяющий преодолеть предел числовой апертуры 0.95 для воздуха (посредством более полного сбора света) и тем самым повысить разрешающую способность объектива (см. рис. 9).

К примеру, в качестве иммерсионной среды может выступать вода, масло, силиконовое масло. Для каждого конкретного образца подбирается своя иммерсия, а выбор наиболее подходящего иммерсионного объектива критичен, поскольку это в значительной степени влияет на качество изображения, особенно при больших увеличениях.

Рисунок 9 – Сравнение иммерсионных сред (воздух с показателем преломления n = 1 и масло с n = 1.51). Свет, проходящий через масло, теряет полезную информацию в меньшей степени

Какова толщина покровного стекла, если оно используется?

На качество изображения объективов с большой ЧА в значительной степени влияют оптические свойства и толщина среды между образцом и фронтальной линзой.

Но и в случае иммерсионных объективов есть свои нюансы — если образец находится в водном растворе на большом удалении от покровного стекла при использовании масляного объектива, возникают сильные аберрации, и объект «размазывается» вдоль оптического пути.  По этой же причине в каких-то случаях предпочтительнее использовать масляный объектив, а в каких-то — водный.

Зачастую в процессе производства покровных стёкол они получаются нестандартной толщины. Для её компенсации проектируются объективы с корректировочным кольцом, поворот которого изменяет расстояние между основными линзами внутри объектива, что позволяет подстраивать объектив под толщину покровного стекла. Кроме того, существуют объективы, которые можно поворотом кольца подстроить под разные иммерсии.

Используете ли Вы продвинутую систему микроскопа?

Помимо широкопольной микроскопии, существуют различные методы исследования посредством микроскопа, такие как конфокальная микроскопия, конфокальная микроскопия с вращающимся диском, мультифотонная лазерная микроскопия, флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения, флуоресцентная корреляционная спектроскопия, флуоресцентная микроскопия плоскостного освещения, лазерная абляция и др. Если Вы применяете одну из таких методик, то выбор подходящего объектива становится критичным. По этой причине необходимо подбирать специальные объективы. Выбор правильного объектива с наибольшей вероятностью улучшит изображение и предоставит лучшую надёжность при выполнении анализа и количественной оценки.

Даниил Гожальский, технический специалист,MSc in Nanotechnology

Теория микроскопии — обзоры, статьи

В данном разделе представлен ряд обзоров по теории оптической микроскопии, предоставляющих информацию как вводного, так и специального характера, позволяющую определиться с выбором оптимальной модели микроскопа, максимально соответствующей поставленным задачам, а так же получить представление о работе его узлов и механизмов.

Такие статьи, как «Об использовании тубуса «бесконечность»», «Ход лучей в отраженном свете», «Фазовый контраст в проходящем свете», «Varel-контраст» и другие относящиеся к оптической микроскопии, предоставляют информацию о различных комплексах мероприятий, применяемых в процессе создания высокоэффективных, точных, надежных и эргономичных приборов, выпускаемых «НПП Фокус».

Помимо обзоров по оптической микроскопии в разделе есть ряд статей описывающих строение микроскопа, характеристики некоторых применяемых объективов, а так же обзоров дающих понятие разрешающей способности и погрешности изображения.

В обзоре «Краткая теория» максимально доступно излагается теория строения и работы оптического микроскопа. Также присутствует статья, в которой дана информация о зеркальных и линзовых осветительных системах микроскопа.

«Свет — самое тёмное место в физике»

Объективы классифицируются по степени коррекции аберраций (оптических искажений) и линейному увеличению:

ПЛАН – в таких объективах исправлены сферические аберрации. Всё изображение резкое и четкое.

АХРОМАТ – в этих объективах исправлены хроматические аберрации для двух длин волн (красный и синий, либо красный и зелёный), то есть волны с этими длинами волн, сфокусированы в одной точке.

ФЛЮОРИТ (ФЛУОТАР, ФЛУОРИТ/ПОЛУАПОХРОМАТ) – в таких объективах скорректированы хроматические аберрации для нескольких длин волн. Так же такие объективы пропускают намного больше света, чем Ахроматы. Применяются для исследований в УФ спектре, поскольку используются специальные стекла с пропусканием в УФ области спектра.

АПОХРОМАТ – в таких объективах скорректированы аберрации для четырех и более длин волн. Обеспечивают превосходную цветопередачу и яркость изображения. Пропускают больше света из ИК и видимого спектра, чем Флюорит, но меньше УФ.

СУПЕРАПОХРОМАТ – самые сбалансированные объективы, отличаются наилучшей цветопередачей. Пропускают волны в видимом диапазоне, УФ и ИК.

Объективы

Маркировка объективов Olympus:

Термины

Числовая апертура – это безразмерная величина, которая характеризует диапазон углов, в которых оптическая система может принимать или испускать свет. В микроскопии от числовой апертуры напрямую зависит и разрешение.

Разрешение – это минимальное различимое расстояние между двумя соседними точками.

Поле зрения – диаметр видимого изображения на исследуемом объекте.

Иммерсия – специальная жидкость с определённым коэффициентом преломления, служащая средой для прохождения света между исследуемым объектом и объективом для увеличения апертуры.

Рабочее расстояние – расстояние от линзы до исследуемого объекта, в пределах которого его изображение будет резким.

Оптическая система с коррекцией на бесконечность – свет, собранный от образца, проходит через линзы объектива параллельными лучами. Параллельные лучи преломляются в линзах тубуса и фокусируется в промежуточное изображение.

Такая корректировка даёт неоспоримые преимущества: можно изменять расстояние между тубусом и объективом, добавлять модули для ортоскопии, коноскопии, дополнительные светоделители и прочие.

Поляризационный объектив (P) – объектив, изготовленный из специального стекла без внутренних напряжений.

Объектив для фазового контраста (PH) – объектив со встроенным фазовым кольцом.

Объективы Olympus подразделяются на сферы использования: для естественных наук и материаловедения. Виды объективов:

UPLSAPO – Универсальные План Суперапохромат, объективы с максимально возможной коррекцией в видимой части спектра, ближнем УФ и ИК. Имеется регулировка рабочего расстояния и апертуры. Такие объективы используются в конфокальных микроскопах и оптических системах сверхвысокого разрешения. Забудьте «мыльное» изображение в школьных микроскопах, в эти объективы вы сможете рассмотреть даже органеллы клеток, но для этого класса оборудования, такая задача не ставится. Такие объективы предназначены для конфокальных микроскопов, слайд-сканнеров и инспекционных систем. Обратите внимание на график светопропускания. Многие ошибочно думают, что пропускание такого широкого спектра лучей – невозможно, но факты говорят сами за себя.

PLAPON – План Апохромат, объективы с коррекцией в видимом диапазоне, ближнем УФ и частично ИК. Хорошее решение для спектрометрии и исследований в ИК диапазоне.

UPLFLN – Универсальные План Флюорит, объективы с коррекцией в видимом диапазоне и УФ. Предпочтителен при недостатке освещения, т.к. пропускает больше всего света. Лучшие друзья биологов, медиков и криминалистов. Слабая флуоресценция – серьёзная проблема для естественных наук, а учитывая, что каждая линза, даже просветлённая, рассеивает 2-5% света. В системе из 8 линз недостаток чувствуется очень остро. В этих объективах используется специальное низкодисперсное (UD) стекло и минерал флюорит, которое пропускает максимально возможное количество света. Изображение в этих объективах выглядит максимально сочным, ярким и резким, потому что в нём скорректированы практически все хроматические аберрации. У флюоритов низкий уровень дисперсии, поэтому расхождение света минимально и пользователь не видит цветного гало, даже на максимальном приближении.

PLN – План Ахромат, объективы с коррекцией в видимом диапазоне (голубой, зелёный, жёлтый). Эти объективы – стандарт для любой клинико-диагностической лаборатории. Хорошо пропускают свет во всём видимом спектре, а План коррекция позволяет работать со всем полем зрения без дополнительной перефокусировки.

ACHN – Ахромат, объективы без коррекции сферических аберраций, но с частичной коррекцией хроматизмов. Эти недорогие объективы подойдут для образовательных учреждений и любителей.

LCACHN – Ахромат с большим рабочим расстоянием, недорогие объективы предназначенные для исследования объектов с выраженным неровным профилем.

CPLFLN – План Флюорит для прецентрированного фазового контраста. Прецентрированный фазовый контраст, это одно из чудес современной оптики, ведь его нельзя сбить и не нужно каждый раз тратить время на точную настройку. У этих объективов большое рабочее расстояние, поэтому их используют в инвертированных микроскопов для микроскопии культур в специальной посуде.

APO – Апохромат, скорректированы многие хроматические аберрации в видимом, ближнем УФ и ИК диапазоне. Передаёт истинные цвета изображения и может использоваться для цитологии и гистологии.

UPLFL-P – План Флюорит для поляризации, сочетает в себе все достоинства флюорита и свободного от внутренних напряжений стекла. Универсальный светосильный объектив, в сочетании с линзой Бертрана отлично подходит для поляризации и ДИК. Эти объективы используют кристаллографы и минерологи, криминалисты, исследователи различных волокон. Поляризация один из основных методов контрастирования, ведь она не требует предварительной подготовки образцов, поэтому данные объективы широко распространены.

XLFLUOR – Флюорит для флуоресцентных исследований на малых увеличениях. Объектив уникален как по позиционированию, так и по исполнению. Обнаружить флуоресценцию в крупных объектах гораздо сложнее, чем рассмотреть её на большом увеличении. Всё дело в засветке и крайне малой светимости для малого увеличения, но у этого объектива малое поле зрения, максимально возможная (для малого увеличения) апертура, а значит высокая чувствительность.

MPLAPO – План Ахромат для материаловедения. Рассчитан на работу в отражённом свете, то есть свет падает через объектив на образец и отразившись от образца проходит через объектив и попадает на окуляры. Блики от осветителя отражённого света отсутствуют. Эти объективы устанавливаются в металлографических микроскопах, микроскопах для исследований нано материалов и мельчайших структур. В первую очередь – это исследовательские объективы.

MPLFLN – План Флюорит для материаловедения. Хорошая просветлённая оптика отлично подойдёт для изучения материалов, а ультрафиолете, а также ДИК контрасте.

MPLFLN-BD – План Флюорит для материаловедения, для светлого и тёмного поля. Свет в этом объективе попадает от осветителя на образец, через специальные каналы в стенках объектива, благодаря чему, реализуется метод тёмного поля.

MPLFLN-DBP — План Флюорит для материаловедения, для светлого, тёмного поля и поляризации. Отличается от предыдущего оптикой без напряжений. Лучшее, из доступного на данный момент, в среднем ценовом сегменте профессиональных микроскопов.

LMPLFLN – План Флюорит для материаловедения с большим рабочим расстоянием. Сделать объектив с большим рабочим расстоянием – весьма нетривиальная задача, потому что длиннофокусные линзы дают менее чёткое изображение.

MPLN – План Ахромат для материаловедения. Рядовые объективы, которые отлично подойдут для несложных исследований в металлографии, химии и электронике.

MPlanIR – Объективы для ИК микроскопии. Переключение между ИК и видимым освещением требует от обычного объектива фокусировку и подстройку освещения. С ИК коррекцией этого делать не нужно. Это не только экономия времени, но и повышенная точность.

Методики контрастирования при работе с микроскопом

При работе с микроскопом исследователи часто сталкиваются с низким контрастом изображения в окулярах и на фотокамере. Иногда крайне затруднительно различить мельчайшие дефекты на кремниевой пластине или определить рельеф поверхности образца. Причин может быть несколько, но в основном это несоответствие условий освещения задачам наблюдения. В этой статье речь пойдет о повышении информативности изображения при использовании специальных фильтров и оптических компонентов, меняющих природу формирования изображения. Мы рассмотрим методики контрастирования на микроскопах отраженного и проходящего света, подробно отразив схемы хода лучей.

Темное поле/косопадающий свет

При освещении объекта коаксиальным светом через объектив очень сложно оценить топографию поверхности объекта или микродефекты образца из-за отсутствия теневых областей. Иногда бестеневое освещение необходимо (в случае реставрационных работ под стереомикроскопом или при проведении каких-либо хирургических операций), но в случае, когда нам необходимо определить рельеф поверхности, тени – единственное, за что сможет зацепиться наше зрение. Для того, чтобы создать рельефную контрастную картину, необходимо осветить объект сбоку так называемым косопадающим светом. На стереомикроскопе при помощи специальных осветителей типа «гусиная шея» сделать это не составит труда, в то время как на лабораторном микроскопе крошечное рабочее расстояние объектива не позволит вводить источник света сбоку. На помощь в таком случае нам придут темнопольные объективы (индекс BD – Brightfield/Darkfield).

Темное поле в отраженном свете.1 — осветитель отраженного света, 2 — система конических зеркал, 3 — наклонное кольцевое зеркало, 4 — темнопольный объектив, 5 — образец на предметном столе

Такие объективы обладают дополнительным металлическим цилиндром снаружи, являющимся проводником и отражателем света. Свет не попадает через объектив непосредственно в поле зрения, но попадает через полый цилиндр на поверхность образца вне поля зрения, и, отражаясь от нее, обеспечивает предельно косопадающее освещение видимой области. Микрочастицы, расположенные на ровной поверхности образца, начинают светиться, трещины и прочие дефекты резко подчеркивают грани. При работе в проходящем свете достаточно воспользоваться темнопольной вставкой в конденсор — метод А. При работе с объективами с высокой числовой апертурой необходимо использовать диафрагму, отрезающую проходящий свет из конденсора — метод B.

Темное поле в проходящем свете. ( Метод А: темнопольная вставка в конденсоре)1 — вставка в конденсор, 2 — конденсорная линза, 3 — образец, 4 — объектив

Темное поле в проходящем свете. ( Метод В: апертурная диафрагма объектива с высокой NA, отрезающая проходящий свет)1 — темнопольная вставка в конденсор, 2 — конденсорная линза, 3 — образец, 4 — объектив, 5 — апертурная диафрагма

Фазовый контраст используется в основном в биологии для изучения живых неокрашенных клеток. Метод основывается на разности оптической плотности (показателя преломления) разных частей наблюдаемого объекта, а также среды, в которую образец заключен. Например, упрощенно рассматривая клетку, расположенную в водном растворе, мы сможем выделить три зоны: А (водный раствор), В (цитоплазма) и С (ядро).

Метод фазового контраста в проходящем свете.1 — фазовая вставка в конденсор, 2 — линза конденсора, 3 — образец, 4 — объектив, 5 — фазовое кольцо в объективе, 6 — лучи со сдвигом фазы, 7 — луч без запаздывания

Световые волны незначительно смещаются, проходя через различные среды, из-за разности показателя преломления. Причем, помимо геометрического смещения, происходит явление запаздывания — смещение фазы. До прохождения через препарат волны света находятся «в фазе», а после прохождения через различные материалы — уже нет. Величина фазового смещения будет зависеть от оптической плотности материалов, а также от величины пути в этих средах. Наш глаз не может заметить разность фаз в изображении. Он различает только разницу интенсивности и разницу цвета. Метод фазового контраста позволяет преобразовать значения фазового сдвига в значения интенсивностей света.

В конденсор микроскопа вставляется специальная фазовая вставка (кольцевая диафрагма, схожая с темнопольной вставкой). Свет, прошедший через нее, формируется конденсором и освещает препарат. Весь пучок света поступает в объектив и в зрачке объектива формируется изображение фазовой вставки. В этом месте в объективе расположено нанесенное на стекло фазовое кольцо — оптический материал, снижающий интенсивность излучения и придающий свету постоянное фазовое смещение. Если в препарате содержатся объекты, изменяющие направление луча (как клетки и их ядра), то свет из прямого луча отклоняется на новую траекторию. Этот свет не проходит сквозь фазовое кольцо, не ослабляется и не задерживается. Все частичные лучи объединяются тубусной линзой и формируют промежуточное изображение.  В нем частичные лучи, поступающие с различными фазами, ослабляются или усиливаются, накладываясь друг на друга. Таким образом, разность фаз превращается в разницу интенсивностей, которую может регистрировать наш глаз.

Метод фазового контраста незаменим при работе с живыми клетками, проведении ЭКО, различных манипуляциях с неокрашенными препаратами.

Поляризация

Поляризация – широко применяющийся метод контрастирования, меняющий физику изображения. Этот метод позволяет убрать блики поверхностей с высоким коэффициентом отражения, получить качественное и насыщенное изображение, но главное – с поляризацией возможно проведение петрографических исследований и измерений углов поляризации для определения состава объекта. Для проведения поляризационных исследований необходимо два компонента – поляризатор (обычно неподвижный) и анализатор (обычно вращаемый). Два фильтра (поляризатор и анализатор), введенные последовательно в ход лучей и повернутые относительно друг друга на 90 градусов, не пропускают свет. Первый фильтр изменяет плоскость поляризации света таким образом, что пропущенный им свет не может пройти через второй фильтр (анализатор). Реализация поляризованного освещения в микроскопе достаточно простая задача. При работе с проходящим светом поляризатор устанавливается в конденсор, а анализатор находится за объективом. В отраженном свете анализатор остается на своем месте, а поляризатор устанавливается перед дихроичным зеркалом сразу после апертурной диафрагмы осветителя отраженного света. В обоих случаях образец освещается плоскополяризованным светом. Если образец при освещении поворачивает направление колебаний поляризованного света из плоскости заданной поляризатором, то в окулярах мы начинаем видеть свет, который частично пропускает анализатор. Явление поляризации характерно прежде всего для таких кристаллов как минералы, а также для полимеров.

Поляризация в отраженном свете.1 — осветитель, 2 — поляризатор, 3 — дихроичное зеркало, 4 — объектив, 5 — образец, 6а — лямбда-пластина, 6 — анализатор, 7 — тубусная линза

Поляризация в проходящем свете.1. поляризатор, 2 — конденсор, 3 — образец, 4 — объектив, 5а — лямбда пластина, 5 — анализатор, 6 — тубусная линза

Обычно в оптический путь перед анализатором вводят компенсатор «Лямбда-пластину» (иногда его называют красной пластиной первого порядка). Линейно поляризованный луч в кристалле компенсатора раскладывается на 2 луча: обыкновенный и необыкновенный, близкие по интенсивности. При выходе из компенсатора необыкновенный луч получает запаздывание на одну длину волны относительно обыкновенного. Но поскольку обыкновенный и необыкновенный лучи поляризованы по-разному, то интерферировать они не могут. Пройдя анализатор, установленный перпендикулярно поляризатору, оба луча будут ослаблены наполовину, но их плоскости поляризации теперь совпадут. Лучи интерферируют, и, в результате, поле зрения окрашивается в розово-красный цвет (как правило разность хода волн в компенсаторе порядка 580 нм). Если между поляризатором и компенсатором окажутся оптически-активные включения, то для прошедших через них лучей условия интерференции будут другими, и изменится их цвет. То есть компенсатор осуществляет цветовое контрастирование оптически-активных объектов. Углом поворота компенсатора можно в определенной мере менять цвет фона и «раскраску» объектов, но при угле 45 градусов относительно поляризатора и анализатора будет получена максимальная интенсивность.

Механические напряжения в стекле приводят к двулучепреломлению, оказывающему воздействие на поляризованный свет. Часто для проведения количественных поляризационных исследований используют специальные объективы, не обладающие внутренними напряжениеями, они имеют маркировку Pol.

Дифференциально-интерференционный контраст Номарского (DIC, ДИК)

Дифференциально-интерференционный метод контрастирования (DIC) является, в некотором виде, комбинацией методов фазового и поляризационного контраста. В проходящем свете дифференциально-интерференционный контраст реализуется несколько сложнее из-за использования двух ДИК-призм (двулучепреломляющие призмы). Ход лучей при ДИК контрастировании схож с поляризационным методом, но дополнительно в оптический путь вводятся две ДИК-призмы — в конденсор и вблизи зрачка объектива. Призма в конденсоре осуществляет векторное разложение плоскополяризованного света по двум взаимноперпендикулярным направлениям колебаний и смещает их в боковом направлении так, что в препарате возникает боковое смещение составляющее дельта Х = к * лямбда. К — коэффициент смещения, обычно меньше единицы.

Дифференциально-интерференционный контраст (ДИК контраст) в отраженном свете.1 — осветитель, 2 — поляризатор, 3 — дихроичное зеркало, 4 — ДИК призма, 5 — объектив, 6 — образец, 7а — лямбда-пластина, 7 — анализатор

Дифференциально-интерференционный контраст (ДИК контраст) в проходящем свете.1 — поляризатор, 2 — ДИК призма, 3 — конденсор, 4 — образец, 5 — объектив, 6 — ДИК призма объектива, 7а — лямбда пластина, 7 — анализатор, 8 — тубусная линза

Далее вспомним метод фазового контраста. Если оба частичных луча пройдут через совершенно одинаковые структуры, то они не приобретут разность хода. Но если для частичных пучков имеются различные условия (разная оптическая плотность образца), то каждый из них на выходе из образца приобретает свою разность хода. Частичные пучки собираются второй ДИК призмой, анализатор выбирает из смещенных по фазе волновых комплектов только те, которые колеблются в направлении анализатора. Таким образом, после анализатора мы получаем лучи, колеблющиеся в одном направлении и разные по фазе. Накладываясь друг на друга, лучи интерферируются и, таким образом, фазовый сдвиг превращается в разность интенсивности. Посредством лямбда-пластины достигается дополнительный цветовой контраст. Метод показывает только «продольные» изменения, следствием чего является получение рельефных изображений. Д ИК в проходящем свете превосходно подходит для отображения отдельных сечений неокрашенных толстых объектов.