ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ИММЕРСИОННОГО МИКРОСКОПА РАЗРЕШЕНИЕ ЗНАЧИТЕЛЬНО УВЕЛИЧИВАЕТСЯ ОБЕСПЕЧИВАЯ ИСКЛЮЧИТЕЛЬНУЮ ТОЧНОСТЬ АНАЛОГИЧНЫМ ОБРАЗОМ В ОБЛАСТИ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ ПОРОГ РАЗРЕШЕНИЯ СУЩЕСТВЕННО ПОВЫШАЕТСЯ ДОСТИГАЯ ПРЕДЕЛА 9 8 3

Микроскоп

Микроскоп предназначен для наблюдения мелких объектов с большим увеличением и с большей разрешающей способностью, чем дает лупа. Оптическая система микроскопа состоит из двух частей:
объектива и окуляра. Объектив микроскопа образует действительное увеличенное обратное изображение предмета в передней фокальной плоскости окуляра. Окуляр действует как лупа и образует мнимое изображение
на расстоянии наилучшего видения (рис. 6.4). По отношению ко всему микроскопу рассматриваемый предмет располагается в передней фокальной плоскости.

Рис. 6.4. Оптическая схема микроскопа.

Увеличение микроскопа

Действие микрообъектива характеризуют его линейным увеличением:

– фокусное расстояние микрообъектива,

– расстояние между задним фокусом объектива и передним фокусом окуляра, называемое оптическим интервалом или оптической длиной тубуса.

Изображение, создаваемое объективом микроскопа в передней фокальной плоскости окуляра рассматривается через окуляр, который действует как лупа с видимым увеличением:

Общее увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра:

Если известно фокусное расстояние всего микроскопа, то его видимое увеличение можно определить так же, как и у лупы:

Как правило, увеличение современных объективов микроскопов стандартизованное и составляет ряд чисел: 10, 20, 40, 60, 90, 100 крат. Увеличения окуляров тоже имеют вполне определенные
значения, например 10, 20, 30 крат. Во всех современных микроскопах имеется комплект объективов и окуляров, которые специально рассчитываются и изготавливаются так, что подходят друг к другу, поэтому
их можно комбинировать для получения разных увеличений.

Поле зрения микроскопа

Поле зрения микроскопа зависит от углового поля окуляра

, в пределах которого получается изображение достаточно хорошего качества:

При данном угловом поле окуляра линейное поле микроскопа в пространстве предметов тем меньше, чем больше его видимое увеличение.

Диаметр выходного зрачка
микроскопа

Диаметр выходного зрачка микроскопа вычисляется следующим образом:

– передняя апертура микроскопа.

Диаметр выходного зрачка микроскопа обычно немного меньше диаметра зрачка глаза (0.5 – 1 мм).

При наблюдении в микроскоп зрачок глаза нужно совмещать с выходным зрачком микроскопа.

Разрешающая способность
микроскопа

Одной из важнейших характеристик микроскопа является его разрешающая способность. Согласно дифракционной теории Аббе, линейный предел разрешения микроскопа, то есть минимальное
расстояние между точками предмета, которые изображаются как раздельные, зависит от длины волны и числовой апертуры микроскопа:

Предельно достижимую разрешающую способность оптического микроскопа можно сосчитать, исходя из выражения для апертуры микроскопа (

). Если учесть, что максимально возможное значение синуса угла – единичное (

), то для средней длины волны

можно вычислить разрешающую способность микроскопа:

Из выражения (6.11) следует, что повысить разрешающую способность микроскопа можно двумя способами: либо увеличивая апертуру объектива, либо уменьшая длину волны света, освещающего
препарат.

Иммерсия

Для того чтобы увеличить апертуру объектива, пространство между рассматриваемым предметом и объективом заполняется так называемой иммерсионной жидкостью – прозрачным веществом
с показателем преломления больше единицы. В качестве такой жидкости используют воду (

), кедровое масло (

), раствор глицерина и другие вещества. Апертуры иммерсионных объективов большого увеличения достигают величины

, тогда предельно достижимая разрешающая способность иммерсионного оптического микроскопа составит

Применение ультрафиолетовых лучей

Для увеличения разрешающей способности микроскопа вторым способом применяются ультрафиолетовые лучи, длина волны которых меньше, чем у видимых лучей. При этом должна быть
использована специальная оптика, прозрачная для ультрафиолетового света. Поскольку человеческий глаз не воспринимает ультрафиолетовое излучение, необходимо либо прибегнуть к средствам, преобразующим
невидимое ультрафиолетовое изображение в видимое, либо фотографировать изображение в ультрафиолетовых лучах. При длине волны

разрешающая способность микроскопа составит

Кроме повышения разрешающей способности, у метода наблюдения в ультрафиолетовом свете есть и другие преимущества. Обычно живые объекты прозрачны в видимой области спектра, и поэтому перед
наблюдением их предварительно окрашивают. Но некоторые объекты (нуклеиновые кислоты, белки) имеют избирательное поглощение в ультрафиолетовой области спектра, благодаря чему они могут быть «видимы»
в ультрафиолетовом свете без окрашивания.

Полезное увеличение микроскопа

Глаз наблюдателя сможет воспринимать две точки как раздельные, если угловое расстояние между ними будет не меньше углового предела разрешения глаза. Для того чтобы глаз наблюдателя
мог полностью использовать разрешающую способность микроскопа, необходимо иметь соответствующее видимое увеличение.

– это видимое увеличение, при котором глаз наблюдателя будет полностью использовать разрешающую способность
микроскопа, то есть разрешающая способность микроскопа будет такая же, как и разрешающая способность глаза.

Если две точки в передней фокальной плоскости микроскопа расположены друг от друга на расстоянии

, то угловое расстояние между изображениями этих точек

. Из выражений (6.11) и (6.8) можно вывести видимое увеличение микроскопа:

Поскольку обычно диаметр выходного зрачка микроскопа около 0.5 – 1 мм, угловой предел разрешения глаза 2´ – 4´. Если взять среднюю длину волны в видимой области спектра
(0.5 мкм), то для полезного увеличения микроскопа можно вывести зависимость:

Микроскоп с видимым увеличением меньше 500А не позволяет различать глазом все тонкости структуры предмета, которые изображаются как раздельные данным объективом (

). Использование видимого увеличения больше 1000А нецелесообразно, так как разрешающая способность объектива не позволяет полностью использовать
разрешающую способность глаза (

Темнопольная микроскопия

Движение
бактерий и спирохет можно наблюдать в
темнопольном, который отличается от
обычного светового спосо­бом освещения
препарата. В этом случае применяют
боковое освещение, в силу чего получается
изображение светяще­гося объекта на
темном фоне. Принцип темного поля основан
на том, что падающие сбоку световые лучи
отклоняются плотными частицами (в
частности, микробами) и последние
благодаря этому представляются глазу
наблюдателя ярко светящимися. Бо­ковое
освещение в микроскопе можно получить,
заменив, обычный осветитель специальным
конденсором с затемнением в центре.
Такой конденсор задерживает все
центральные лучи света и пропускает
лишь периферические (рис.3). Вместо
специального конден­сора для темного
поля можно пользоваться обычным
осветите­лем, между двумя линзами
которой вставляют кружок черной бу­маги
несколько меньшего диаметра, чем линза.
Работать надо с сильным источником
света (дуговой лампой или обычной
лампоч­кой в 200-300 свечей). Техника
исследований заключается в следующем.
На предметное стекло наносят каплю
материала и осторожно накрывают покровным
стеклом, чтобы не было пузырь­ков
газа. Затем на поверхность конденсора
помещают каплю воды или кедрового масла,
и предметное стекло с препаратом кладут
на эту каплю.

Препарат
рассматривают либо через сильную сухую
систему (объектив 40),
либо через иммерсионную систему. В
последнем случае на покровное стекло
также наносят каплю кедрового масла, а
к иммерсии привинчивают маленькую
муфточку – диа­фрагму, чтобы сузить
диаметр просвета объектива.

При
микроскопии этим методом лучи, освещающие
объект, не попадают в объектив микроскопа,
поле зрения остается темным, а объект
на его фоне кажется светящимся (рис. 4).
Эффект темного поля создается при помощи
специального конденсора (параболоид
или кардиоид) или обычного конденсора
с прикрытой кружком черной бумаги
центральной частью.

Для
наблюдения в темном поле свет устанавливают
и цен­трируют, как для светлого поля,
и, заменив конденсор специ­альным,
прибавляют свет до максимума, раскрыв
до отказа диа­фрагму и включив реостат
осветителя.

Препараты
для исследования в темном поле должны
быть приготовлены на очень чистых
предметных и покровных стеклах
определенной толщины: предметные – не
более 1,2 мм, покров­ные – 0,17 мм. Готовят
препарат по типу «раздавленной»
или «висячей» капли (рис. 5). Между
препаратом и конденсором помещают
иммерсионное масло (каплю его наносят
на верхнюю линзу конденсора). После
этого, поднимая и опуская конденсор,
добиваются появления в поле зрения
светлого пятна, которое с помощью
специальных регули­ровочных винтов
конденсора выводят в середину поля
зрения. Затем с помощью нужного увеличения
переходят к наблюдению.

Фазово-контрастная и аноптральная микроскопия

Фазово-контрастный
микроскоп значительно повышает
контра­стность объектов, проницаемых
для света, и в медицине ис­пользуется
для изучения нативных препаратов. С
помощью этого метода могут быть
исследованы без предварительной
обработки бесцветные, прозрачные
объекты, детали, строение которых
оп­тически мало различаются между
собой.

Окрашенные
препараты частично поглощают свет.
Пучок света, проходящий через такой
препарат, теряет в своей ин­тенсивности,
т.е. уменьшается амплитуда световой
волны, и это легко улавливается глазом
исследователя. Такие препараты контрастны
даже в обычном микроскопе и называются
“амплитуд­ными”. Препараты, не
поглощающие света, прозрачны. Пучок
света, проходящий через такой препарат,
не теряет своей ин­тенсивности.
Амплитуда световой волны не изменяется,
а лишь изменяется фаза колебания, что
не регистрируется человече­ским
глазом. Такие объекты называются
фазовыми. К ним отно­сятся живые,
неокрашенные препараты. Чтобы повысить
контра­стность изображения, необходимо
превратить фазовые изменения в
амплитудные. Это достигается путем
помещения в объективы фазовой пластинки
в форме кольца и применением кольцевой
диафрагмы. Каждому объективу соответствует
своя диафрагма. Изображение этой
диафрагмы совпадает с кольцом фазовой
пла­стинки соответствующего объектива.
Метод фазовых контрастов может быть
положительным и отрицательным. В первом
случае на светлом фоне поля наблюдается
темное изображение объекта, а во втором
фон темный, а объект светлый. Наилучшие
результаты наблюдаются в случае
положительного контраста.

Распространение
световых волн в прозрачных однородных
объектах не сопровождается потерей
интенсивности света. Ме­няется только
скорость прохождения светового потока
через объект по сравнению со скоростью
распространения света в окружающей
среде. Она будет большей или меньшей в
зависимости от того, будет ли показатель
светопреломления объекта соответственно
меньше или больше, чем в окружающей
среде. Эти изменения, называе­мые
иначе фазовыми, так как при них меняются
только фаза ко­лебаний прошедшего
света, характерны для большинства
биоло­гических объектов (живых клеток,
срезов тканей и т. п.).

Человеческий
глаз хорошо определяет изменения
интенсив­ности света, наступающие
при прохождении через окрашенные
(амплитудные) препараты, когда меняется
амплитуда колебаний света. Однако глаз
не способен воспринимать фазовые
измене­ния света. Поэтому прозрачные
неконтрастные (фазовые) объ­екты при
обычном микроскопическом исследовании
остаются не­видимыми.

Для
работы по методу фазового контраста
нужно, кроме обычного биологического
микроскопа, иметь еще специальное
устройство. Установку устройства
производят следующим обра­зом.
Конденсор и объектив заменяют фазовыми.
Фазовый конден­сор поворотом
револьверного диска устанавливают на
0. Это положение соответствует обычному
светопольному конденсору. Затем, поместив
на предметный столик препарат и
сфокусировав его, приступают к наладке
освещения. При исследовании мето­дом
фазового контраста основным условием
является оптималь­ная освещенность,
которая достигается установкой света
по Келеру. После этого устанавливают
револьверный диск на то число, которое
соответствует выбранному объективу;
например, при объективе 40
в окошечке также устанавливают цифру
40. Вынув окуляр, на его место устанавливают
вспомогательный микроскоп и настраивают
его на изображение двух колец (коль­цевая
диафрагма конденсора и фазовая пластинка).
Центро­вочным устройством конденсора
добиваются совмещения колец. Заменив
вспомогательный микроскоп окуляром,
можно произво­дить исследование
препарата.

Метод
аноптрального контраста является
усовершенствованием метода фазового
контраста. Теоретические обоснования
и конструктивные особенности аноптрального
устройства, в основном не отличаются
от обычной фазово-контрастной установки
(рис. 6). Принцип его устройства заключается
в следующем. На верхнюю поверхность
предпоследней линзы иммерсионного
объектива наносится кольцо из сажи,
пропускающей лишь около 10%
проходящего света. В передней фокальной
плоскости кон­денсора помещается
кольцевая диафрагма, изображение которой
должно полностью совпадать с кольцом
сажи на объективе. Пре­парат освещается
полным конусом лучей, проходящих через
кольцевую диафрагму конденсора. При
отсутствии объектов (например, микробов
в препарате) в объектив попадают только
недифрагированные лучи, амплитуда
которых, после того как они пройдут
через кольцо сажи, уменьшится на 90%.
В то же время амплитуда лучей,
дифрагированных частицами объекта,
которые пройдут мимо кольца из сажи, не
изменится и поэтому фон поля будет
темный, а частицы объекта светлыми.
Пре­имуществом метода аноптральной
микроскопии является боль­шая
разрешающая способность объективов и
возможность выяв­ления минимальных
оптических разностей плотности в
неокра­шенных препаратах. Чем больше
оптическая плотность объекта, тем
светлее его изображение. Методика
использования устрой­ства не отличается
от фазово-контрастного. При помощи
аноптрального микроскопа можно изучать
морфо­логию и локализацию нуклеоидов
(ядерный аппарат), наблюдать за изменениями
морфологии бактерий в процессе нормального
роста и размножения.

Предельно
достижимую разрешающую способность
оптического микроскопа можно сосчитать,
исходя из выражения для апертуры
микроскопа (

,где
n
– показатель преломления среды, α –угол
падения света).
Повысить разрешающую способность
микроскопа можно двумя способами: либо
увеличивая апертуру объектива (заполняя
пространство между рассматриваемым
предметом и объективом иммерсионной
жидкостью –
прозрачным веществом с показателем
преломления больше единицы, либо
уменьшая длину волны света, освещающего
препарат (УФ-, рентгеновское излучение).

Микроскопия темного поля

Для
микроскопии в темном поле при­меняются
особые конденсоры, у которых центральная
часть линзы за­темнена, за исключением
узкой полоски по периферии. При
работе по методу темного поля, препарат
освещается полым световым конусом,
апертура которого больше, чем апертура
объектива, таким образом, входной зрачок
микрообъектива оказывается в области
геометрической тени и прошедший без
преломления свет не попадает в объектив.
В оптической
микроскопии тёмного
поля неоднородности образца рассеивают
свет, и этот рассеянный свет формирует
изображение исследуемого образца.

Особенностью микроскопа темного
поля является способ освещения образца,
который осуществляется «сбоку» (зеленая
полоса на рисунке). При таком освещении
неоднородности, имеющиеся в образце,
рассеивают падающий свет и в микроскопе
изображение образца наблюдают
в рассеянном свете,
а «освещающий» световой пучок не
попадает в объектив. Такое освещение
называется эпи-подсветкой.

Преимущество
микроскопии в темном поле зрения состоит
в том, что при этом можно видеть объекты
более мелкие. Кроме того, в тем­ном
поле зрения лучше наблюдать в живом
состоянии такие микробы, как лептоспиры,
которые в водной среде не преломляют
света и поэто­му в проходящем свете
совершенно прозрачны. Основным
ограничивающим фактором метода является
то, что только малая часть падающего
света в итоге формирует изображение,
поэтому необходимо применять достаточно
мощные источники света, что иногда
приводит к повреждениям образца (сейчас
иногда используют лазеры). Значительное
ограничение метод накладывает на
разрешающую способность системы —
апертура объективов, работающих по
методу темного поля существенно ниже
светлопольных, так как она не должна
перекрывать затемненную часть апертуры
конденсора.
Применение:
Темнопольная
микроскопия может применяться для
прижизненного изучения неокрашенных
биологических объектов — простейших,
изолированных клеток, тканевых культур,
для исследования субклеточных структур
живых неокрашенных клеток.
Темнопольная
микроскопия в последнее время используется
в производстве компьютерных
мышей с
тем чтобы обеспечить работу оптических
мышей в том числе и на прозрачных
стёклах, имеющих микроскопические
дефекты или пыль на поверхности.

8)
Ближнепольная оптическая микроскопия
—
оптическая
микроскопия, обеспечивающая разрешение
лучшее, чем у обычного оптического
микроскопа. Повышение разрешения БОМа
достигается детектированием рассеяния
света от изучаемого объекта на расстояниях
меньших, чем длина волны света. В
случае, если зонд (детектор) микроскопа
ближнего поля снабжен устройством
пространственного сканирования, то
такой прибор называют сканирующим
оптическим микроскопом ближнего поля.
Такой микроскоп позволяет получать
растровые изображения поверхностей и
объектов с разрешением ниже дифракционного
предела.
Зондом служит оптический волновод
(световолокно), сужающийся на том конце,
который обращен к образцу, до диаметра
меньше длины волны света. Световая
волна при этом не выходит из волновода
на большое расстояние, а лишь слегка
“вываливается” из его кончика. На
другом конце волновода установлены
лазер и приемник отраженного от
свободного торца света. При малом
расстоянии между исследуемой поверхностью
и кончиком зонда амплитуда и фаза
отраженной световой волны меняются,
что и служит сигналом, используемым
при построении трехмерного изображения
поверхности.

Если
заставить свет пройти через диафрагму
диаметром 50-100 нм и приблизить ее на
расстояние несколько десятков нанометров
к поверхности исследуемого образца,
то, перемещая такой «источник света»
по поверхности от точки к точке (и
обладая достаточно чувствительным
детектором), можно исследовать оптические
свойства данного образца в локальной
области, соответствующей размеру
отверстия.

Именно
так устроен сканирующий ближнепольный
оптический микроскоп (СБОМ). Роль
отверстия (субволновой диафрагмы)
обычно выполняет оптоволокно, один
конец которого заострен и покрыт тонким
слоем металла, везде, кроме небольшой
области на самом кончике острия (диаметр
«незапыленной» области как раз составляет
50-100 нм). С другого конца в такой световод
поступает свет от лазера.

Схема
устройства ближнепольного оптического
микроскопа

С
помощью СБОМ можно изучать оптические
явления с пространственным разрешением
30-50 нм. Отличительной особенностью СБОМ
является принципиальная необходимость
работать с очень слабыми сигналами.

Полезное
увеличение – это видимое увеличение,
при котором глаз наблюдателя будет
полностью использовать разрешающую
способность микроскопа, то есть
разрешающая способность микроскопа
будет такая же, как и разрешающая
способность глаза. И ЛИ.
Увеличение микроскопа в пределах
500-1000Аназывается полезным, т.к. при нем
глаз различает все элементы структуры
объекта, разрешаемые микроскопом.
Полезное увеличение γM
микроскопа должно быть не меньше
величины, определяемой соотношением
пределов разрешения глаза Zгл
и микроскопа ZM:
γM.

Предмет
АБ находится впереди от переднего фокуса
объектива. Изображение А’Б’ строится
по обычным правилам построения в
собирающей линзе, оно лежит за двойным
фокусным расстоянием объектива (к
окуляру ближе, чем передний фокус). Лучи,
образующие точку Б’, надо продолжить
до пересечения с главной плоскостью
окуляра в точках l
и l’.
Через оптический центр окуляра O’
проводятся побочные оси, параллельные
этим лучам, до пересечения в точках m
и c
фокальной плоскости MN
окуляра, которая совпадает с главной
плоскостью глаза. Аналогично через
оптический центр глаза O’’
проводятся побочные оси, параллельные
отрезкам lm
и ln,
до пересечения с фокальной плоскостью
глаза Фгл.
Проведя лучи через эти точки и точки m
и n,
получим за фокальной плоскостью глаза
точку Б’’’, изображенную на сетчатке
глаза. Точка Б’’ мнимого изображения
найдется как пересечение продолжения
отрезков lm
и ln.
Таким образом, микроскоп дает увеличенное,
перевернутое и мнимое изображение.
Апертурная
диафрагма-диафрагма,
ограничивающая световой поток независимо
от места ее расположения в оптической
системе (диафрагма может располагаться
и перед входной линзой прибора). Апертурная
диафрагма ограничивает ширину световых
пучков, поступающих в систему от отдельных
точек предмета, находящихся вне поля
зрения и поэтому падающих на линзу под
большим углом. Диафрагма способствует
устранению аберраций и повышает резкость
изображения, хотя при этом ограничивается
количество световых лучей, попадающих
в оптическую систему, т.е. уменьшается
яркость изображения. Апертурный
угол-это
пространственный угол, ограничивающий
конус световых лучей, попадающих в
линзу. Апертурным углом также называют
плоский угол при вершине этого конуса.

Поглощение света. Закон Бугера. Закон Бугера-Ламберта-Бера. Конценрационная колориметрия. Нефелометрия.

Поглощением
света называется
ослабление интенсивности световой
волны при прохождении через вещество
вследствииствие превращения световой
энергии в другие виды энергии.

Пусть световая
волна интенсивностью Iо
проходит через слой вещества толщиной
d.
Тогда интенсивность световой
волны, прошедшей через вещество дается
выражением:

где α-
показатель поглощения, характеризующий
поглощательную способность вещества.

Он зависит от
природы и состояния вещества, а также
от частоты (длины волны) света.
Эта формула вы а ражает закон
поглощения света Бугера.

График зависимости
интенсивности света от толщины слоя
среды имеет вид:

Показатель
поглощения достаточно высок у металлов
Это объясняется
наличием в металлах свободных
электронов,
вынужденные
колебания которых легко возбуждаются
и имеют значительную амплитуду. Падающая
на поверхность металла световая волна
быстро расходует свою энергию и поэтому
проникает на малую глубину. У диэлектриков
показатель поглощения невелик (α
= 10 -3
– 10-5
см-1),
но у них
наблюдается селективное
поглощение света в определенных
интервалах длин волны,
в которых показатель поглощения резко
возрастает. Это связано с тем, что в
диэлектриках нет свободных электронов
и значительное поглощение света
происходит только при резонансных
колебаниях,
т.е. при частотах световой волны, близких
к собственным (или кратным им) частотам
колебаний электронов диэлектрика.

Примерный
характер зависимости показателя
поглощения α
от длины волны
λ

1-график
для тел, равномерно поглощающих свет
любой длины волны(черные и серые тела).

2-для тел,
поглощающих свет любых длин волн, начиная
с некоторой граничной λгр
3-для
тел, имеющих широкую
полосу поглощения в пределах длин волн
от λ1 до λ2 ;

Поглощение
монохроматического света растворами
окрашенных веществ (при условии, что
растворитель не поглощает света данной
длины волны и раствор имеет невысокую
концентрацию) подчиняется закону
Бугера-
Бера:

где
æ-показатель поглощения для раствора
единичной концентрации, с-концентрация
вещества в растворе.

В
системе десятичных логарифмов формула
примет вид:
Id
=
I0∙10
-æ´Сd

где
æ’ = æ/2,3.

Отношение Id/I0=τ
называется
коэффициентом
пропускания
или прозрачностью
раствора, а величина D=lg(I0/Id)=-lgτ-оптической
плотностью.
В соответствии с приведенной выше
формулой, оптическая плотность раствора
D
= æ´Cd.

На
законе Бугера-Бера основан метод
измерения концентрации растворов
окрашенных веществ ,который называется
концентрационной
колориметрией
,а также метод определения концентрации
вещество в коллоидном растворе ,который
называется нефелометрией

Оптическая микроскопия — что есть что?

Перед тем как начать разговор о методах наблюдения нужно понять, что в микроскопе любого назначения учитываются такие важные параметры как разрешающая способность и полезное увеличение.

Одной из важнейших характеристик микроскопа является его разрешающая способность, т.е. минимальное расстояние между точками предмета, которые изображаются как раздельные. Разрешающая способность зависит от длины волны и числовой апертуры микроскопа. Повысить разрешающую способность микроскопа можно двумя способами: либо увеличивая апертуру объектива, заполнив пространство между рассматриваемым предметом и объективом иммерсионной жидкостью, либо уменьшая длину волны света, освещающего препарат. Для увеличения разрешающей способности также применяют ультрафиолетовые лучи, длина волны которых меньше, чем у видимых лучей.

Для того, чтобы глаз наблюдателя мог полностью использовать разрешающую способность микроскопа, необходимо иметь соответствующее видимое увеличение. Так что же такое полезное увеличение микроскопа? Полезное увеличение – это видимое увеличение, при котором глаз наблюдателя будет полностью использовать разрешающую способность микроскопа, т.е. разрешающая способность микроскопа будет такая же, как и разрешающая способность глаза. Если разрешающую способность микроскопа перевести в математическую величину (мегапиксели) используя дифракционную теорию Аббе, то она окажется равна 3 Mpxl. Таким образом, при использовании фотокамер большого разрешения, а тем более зеркальных фото камер, когда роль глаза выполняет объектив камеры, —  «гонка» за мегапикселями становится бессмысленной, тем более при выводе изображения на экран телевизора. При использовании монитора компьютера полезным разрешением цифровой камеры будет 6 – 10 Mpxl, но тут уже имеют место характеристики видеокарты и монитора ПК.

Существуют пределы полезного увеличения микроскопа. Они лежат в пределах от 500 до 1000 апертур (в данном случае имеется в виду диаметр действующего отверстия, определяемый размерами линз или диафрагм). Таким образом, становится очевидно, что микроскоп с видимым увеличением меньше 500А не позволяет различить глазом все тонкости структуры предмета, которые изображаются как раздельные данным объективом; использование видимого увеличения больше 1000А нецелесообразно, т.к. разрешающая способность объектива не позволяет полностью использовать разрешающую способность глаза.

Теперь про освещение. Обычно предметы, исследуемые под микроскопом, сами не светятся и, следовательно, нуждаются в постороннем освещении. Во многих случаях рассматриваемые предметы представляют собой тонкий срез прозрачного вещества и наблюдаются в проходящем свете. Иногда вполне достаточно рассеянного дневного света, отраженного под углом от вогнутого зеркала. Но чаще всего необходимо пользоваться искусственными источниками и специальными осветительными системами.

В современной микроскопии зеркала уже практически не используются. Основными источниками света стали галогенные лампы, встроенные в систему освещения (штатив) микроскопа. Галогенные лампы – это удобный источник света при обычных исследованиях, их используют для освещения препаратов как проходящим, так и отраженным светом, их можно легко и часто включать и выключать, не опасаясь повредить лампу. Номинальными лампами, исходя из многолетнего опыта конструкторов осветительных систем, являются лампы мощностью 6В; 12Вт, 6В;15Вт, 6В;20Вт, 6В;25Вт, 6В;30Вт – для биологических микроскопов, 12В;10Вт,  12В;15Вт, 12В;20Вт – для стереоскопических микроскопов, 8В;20Вт – для металлографических, 9В;20Вт, 9В;70Вт 12В;50Вт, 12В;100Вт – для поляризационных и специальных измерительных (криминалистических) микроскопов. Для работы в свете люминесценции применяют ртутные 100Вт лампы. Почему именно 100Вт? Лампа мощностью 100Вт имеет меньшую дугу, чем лампы 50Вт и 200Вт, и пики ее длины волны лежат в диапазоне 300-700нм, а средняя плотность свечения достигает 170000Лк (у ламп мощность 50Вт и 200Вт средняя плотность 33000Лк и 30000Лк соответственно). Продолжительность эксплуатации достигает 200 часов.

Что касается использования диодов, то эти работы не дали результатов, т.к. светодиод имеет другой спектральный диапазон и при использовании дает цветовое искажение. Например, при использовании диода в биологическом медицинском микроскопе МИКМЕД-6 для клинического анализа крови лаборант не смог определить составляющие, т.к. существует специальная методика, где дословно прописано, что какого цвета должно быть и как выглядеть. Другими словами, структуру препарата, рассматриваемого через микроскоп, можно различить лишь тогда, когда частицы препарата отличаются друг от друга и от окружающей их  среды по поглощению (отражению) света или по показателю преломления. Поэтому, в зависимости от характера препарата, в микроскопии применяются различные методы наблюдения.

Метод темного поля.

Метод исследования в поляризованных лучах.

Применяется как в проходящем, так и в отраженном свете для так называемых анизотропных объектов, обладающих двойным лучепреломлением или отражением. Такими объектами являются многие минералы, угли, некоторые животные и растительные ткани и клетки, искусственные и естественные волокна.

При исследовании анизотропных препаратов к обычной схеме микроскопа перед осветительной системой добавляют поляризатор, а после объектива – анализатор, находящиеся в скрещенном, либо параллельном положении относительно друг друга. При скрещенном поляризаторе и анализаторе в темном поле зрения микроскопа видны темные, светлые или окрашенные анизотропные элементы объекта. Вид этих элементов зависит от положения объекта относительно плоскости поляризации и от величины двойного лучепреломления. Более точное определение оптических данных объекта делается с помощью различных компенсаторов (неподвижных кристаллических пластинок, подвижных клиньев и пластинок).

Метод фазового контраста.

Фазовый контраст дает возможность получать контрастные изображения прозрачных и бесцветных объектов. К числу таких объектов относятся, например, неокрашенные биологические препараты, нетравленые шлифы металлов и минералогические объекты. Темные и светлые места в фазово-контрастном изображении соответствуют различным показателям преломления в препарате.

Принцип действия метода основан на том, что незаметные для глаза изменения фазы пучка, прошедшего через объект, можно преобразовать в видимое изменение интенсивности. На пути лучей, не отклоненных из-за дифракции на объекте, располагается так называемая «фазовая пластинка», увеличивающая разность фаз до половины длины волны. Таким образом, лучи могут интерферировать, и прежде не видимый объект проявляется на темном или светлом фоне.

Сложный метод окраски по Романовскому-Гимза используют для окрашивания простейших, спирохет, ядерных элементов.

Сухие мазки фиксируют в метиловом спирте (5 мин) или в смеси Никифорова (15 мин), погружают в рабочий раствор (разведение 1:4) краски Романовского-Гимза (состоит из азура, эозина и метиленовой синьки) на 5-7 мин, промывают дистиллированной водой и высушивают. Каждая новая партия красителя требует отработки своего режима окраски, даже если они применяются для одного и того же биоматериала. Краситель можно использовать неоднократно, соблюдая условия хранения.

При окраске по Романовскому-Гимза цитоплазма простейших голубая, ядра красные. Боррелии сине-фиолетовые, трепонемы и лептоспиры слабо-розовые.

Правильно окрашенный по Романовскому-Гимза мазок крови имеет светло-розовую окраску; эритроциты розовые; ядра лейкоцитов фиолетово-красного цвета с хорошо видимой структурой хроматина, хорошо выделяются ядрышки; цитоплазма нейтрофилов светло-розовая; базофильная зернистость синяя, эозинофильная — красная, нейтрофильная – сиреневая, зернистость моноцитов — нежная азурофильная.

3 этап БСМИ. Микроскопия с оценкой формы, размеров, взаимного расположения микробов. Микроскоп (греч. skopeo – смотрю) – оптический прибор для получения увеличенных изображений объектов, не видимых невооружённым глазом. Различают световую (светлопольную, иммерсионную, темнопольную, фазово-контрастную, люминесцентную) и электронную микроскопию.

Светлопольная микроскопия – основной метод исследования клеток и тканей, в котором для освещения объекта используют лучи видимого спектра.

Рис.1. Устройство светового микроскопа

Световой микроскоп (рис. 1) имеет механическую систему и оптическую систему (объектив, окуляр, осветительное устройство). Объективы по способу использования и степени увеличения делятся на сухие — между объективом и рассматриваемым предметом находится воздух и иммерсионные (лат. immersio – погружение) – между объективом и рассматриваемым предметом находится жидкость.

Светлопольная микроскопия предназначена для изучения окрашенных препаратов. Изображение создается за счёт различий в степени поглощения света разными участками исследуемого окрашенного объекта (рис. 2). При прохождении пучка света через окрашенный препарат происходит изменение интенсивности света, т. е. меняется амплитуда световой волны. Такие амплитудные изменения легко улавливаются человеческим глазом.

Возможно применение светлопольной микроскопии и при наблюдении неокрашенных нативных препаратов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив.

При использовании сухого объектива с большим фокусными расстоянием световые лучи, идущие от зеркала через конденсор в объектив, проходят через неоднородные среды, различающиеся показателями преломления. Часть лучей отклоняется и не попадает в объектив. В результате поле зрения освещено недостаточно. Обычная световая микроскопия с сухим объективом, имеющим слабое увеличение, в микробиологии используется редко – для изучения микроорганизмов, имеющих крупные размеры (более 10 мкм).

Чтобы увеличить разрешающую способность микроскопа и исследовать более мелкие микроорганизмы, используют иммерсионную микроскопию. Иммерсионный объектив с фокусным расстоянием 1,5–3 мм (маркирован «ОИ» («ИО») или «МИ» («ИМ»), имеет кольцевую чёрную или белую черту) погружают в каплю масла (кедрового, персикового, при их отсутствии – вазелинового), показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла.

Иммерсионное масло устраняет потери попадающих в объектив лучей

света вследствие своего одинакового со стеклом коэффициента преломления (рис. 3). В этом случае падающий на препарат пучок света не рассеивается и, не меняя направления, попадает в иммерсионный объектив; разрешающая способность микроскопа увеличивается.

Иногда вторую каплю иммерсионной жидкости помещают на верхнюю линзу конденсора. В редких случаях используют водную иммерсию, в этом случае устанавливают объектив «ВИ».

Рис. 3. Схема хода лучей в сухой и иммерсионной системах

Увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Сухие объективы могут иметь увеличение 8, 10, 20, 40, иммерсионные – 90, 100. Окуляры могут иметь увеличение 7, 10, 12, 15. Обычный световой микроскоп даёт увеличение в 100–400 раз, иммерсионный – в 1000 раз.

Качество микроскопа зависит не от степени увеличения, а от его разрешающей способности – минимального расстояния между двумя точками, которое ещё можно различить. Невооружённый человеческий глаз имеет разрешающую способность около 100 мкм. Разрешающая способность светового микроскопа ограничена длиной световых волн. В световых микроскопах с иммерсионной системой при использовании видимой части дневного света можно рассмотреть объекты около 0,2 мкм. Размеры микроорганизмов, имеющих клеточное строение, составляют 0,2–20 мкм (чаще 0,5–10 мкм) и они легко обнаруживаются в иммерсионном микроскопе.

Структуру препарата можно различить лишь тогда, когда разные его частицы по-разному поглощают или отражают свет либо отличаются одна от другой (или от окружающей среды) показателем преломления. Эти свойства обусловливают контрастность изображения – различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3–4 %, то его невозможно уловить.

Другие методы световой микроскопиивыбираются в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов.

Темнопольная микроскопия (ТПМ) – микроскопия с боковым освещением (ультрамикроскопия), позволяет обнаружить частицы размером в несколько миллимикронов, которые не видны в светлопольном микроскопе.

Принцип ТПМ. Микроскопия в тёмном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля).

Эффект тёмного поля создаётся с помощью специального темнопольного конденсора, имеющего боковую зеркальную поверхность или обычного конденсора, между линзами которого вкладывают кружок чёрной фотобумаги так, чтобы незначительная периферическая часть линзы оставалась свободной.

При выходе из темнопольного конденсора основная часть лучей света не попадает в объектив. Изображение в микроскопе формируется при помощи небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата и прошедшими через объектив (рис. 4).

Рис. 4. Ход лучей в темнопольном микроскопе

При микроскопии препарата в тёмном поле зрения на верхнюю линзу конденсора наносят каплю масла, помещают препарат с предметным стеклом, на которое наносят каплю масла. Наносить масло на обе поверхности необходимо, чтобы при иммерсионной микроскопии проходящие лучи света не преломлялись. Можно использовать и сухую систему (объектив х40) и помещать каплю масла только на верхнюю линзу конденсора. Так как для бокового освещения необходим параллельный пучок света, применяется только плоское зеркало. Вместо масла можно использовать дистиллированную воду.

В темнопольном микроскопе в нативных препаратах изучают живых неокрашенных микроорганизмов, напр., спирохет (рис. 5).

Прямые лучи освещают объект не снизу, а сбоку и не попадают в глаза наблюдателя. В объектив попадают лучи, отражённые исследуемым объектом. Неосвещённое поле зрения остаётся совершенно тёмным, а микроорганизмы, отражающие лучи света, выглядят ярко светящимися.

Рис. 5. Treponema pallidum в темнопольном микроскопе

Фазовоконтрастная (ФКМ) микроскопия позволяет исследовать нативные препараты: бесцветные, прозрачные объекты, детали строения которых оптически мало различаются (живые клетки, срезы тканей, микоплазмы).

При ФКМ используют дополнительное фазово-контрастное устройство, состоящее из фазового объектива и фазового конденсора.

Фазовый объектив внутри имеет фазовую пластинку с нанесенным кольцом, которое изменяет фазу и уменьшает амплитуду световой волны. Середина кольца составляет 1/2–2/3 от диаметра выходного зрачка объектива, светопропускание кольца – 10–30% в зависимости от типа фазового контраста.

Фазовый конденсор имеет кольцевую диафрагму с прозрачным световым кольцом. Размер светового кольца подбирается так, чтобы он соответствовал (или был чуть меньше) размеру фазового кольца объектива.

Изображение кольцевой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пластинки соответствующего объектива.

Принцип ФКМ. Человеческий глаз хорошо определяет изменения интенсивности света, наступающие при прохождении через окрашенные препараты, когда меняется амплитуда колебаний света. Распространение же световых волн в прозрачных однородных объектах не сопровождается потерей интенсивности света. Меняется только скорость прохождения света через объект по сравнению со скоростью его распространения в окружающей среде. Эти изменения называются фазовыми, так как при этом изменяется фаза колебаний прошедшего света. Фазовые колебания света глаз не воспринимает, а наблюдаемые объекты выглядят малоконтрастными, прозрачными.

Пучок света, проходя через кольцевую щель диафрагмы и объект, попадает в кольцо фазовой пластинки объектива. Лучи света отклоняются от фазовой пластинки (рис. 6). В результате между лучами, прошедшими через объект, и лучами светового фона возникает разность длины волны.

Таким образом, при использовании фазово-контрастного устройства невидимые фазовые изменения преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения интенсивности (яркости) света, которые различимы глазом.

Получаемое изображение называется фазово-контрастным.

В зависимости от способа получения фазовых колец различают 2 типа фазового контраста:

а) позитивный фазовый контраст, когда фазовое кольцо в объективе технологически получается путем травления, что вносит «опережение» в прямо прошедший свет.

При этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, получается темнее на более светлом фоне (рис. 7). Лучшие результаты наблюдаются при позитивном фазовом контрасте.

Рис. 7. Фазово-контрастная микроскопия Bacillus cereus (позитивный фазовый контраст)

б) негативный (аноптральный) фазовый контраст, когда фазовое кольцо в объективе технологически получается путем нанесения на поверхность стекла тонкой пленки из копоти или меди, поглощающей не менее 10% света. Это вносит «запаздывание» в прямо прошедший свет. При этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, выглядит светлее окружающего темного фона. Аноптральная микроскопия позволяет достичь большей чёткости изображения малоконтрастных живых микроорганизмов.

ФКМпозволяет получить изображения малых прозрачных и бесцветных живых объектов (микроорганизмов, клеток).

Крупные прозрачные объекты рассеивают лучи света на небольшие углы, эти лучи проходят вместе с не отклонёнными через фазовое кольцо. Для крупных объектов фазово-контрастный эффект имеет место только вблизи их контуров, где происходит сильное рассеяние.

Люминесцентная микроскопия. Ее п ринцип основан на использовании явления люминесценции (флюоресценции, холодного свечения) – способности некоторых веществ флюоресцировать, т. е. на доли секунд поглощать падающие на них УФ или коротковолновые (сине-фиолетовые) лучи, а затем снова испускать свет. Испускаемый свет имеет длину волны, превышающую длину волны поглощаемого света на 20–50 нм, т. е. смещен по длине волны в сторону длинноволновой области спектра. Так, например, если поглощается синий свет, то испускается зеленый свет. Зеленый свет преобразуется в желтый, желтый – в красно-оранжевый, а невидимое УФ- излучение – в видимый свет. Такое явление носит название «эффект Стокса».

Первичная (собственная) люминесценция наблюдает­ся без предварительного окрашивания объекта. Вторичная (наведенная) возникает после окраски препаратов специаль­ными люминесцирующими красителями – флюорохромами (акридиновым оранжевым – используют для обнаружения гонококков, аурамином – микобактерий, корифосфином – коринебактерий, ФИТЦ (флюоресцеина изотиоцианатом) – для метки антител).

Основной частью люминесцентного микроскопа является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового цвета, и систему фильтров (рис. 8).

Рис. 8. Схематическое изображение люминесцентного микроскопа

Галогенные лампы непригодны в качестве источника света для люминесцентных исследований, так как металлическая нить накаливания преобразует большую часть потребленной электроэнергии в красный или невидимый инфракрасный свет. При этом лампа имеет непрерывный спектр излучения в широком спектральном диапазоне, непригодный для наблюдения слабосветящихся объектов.

Для работы в свете люминесценции необходим источник света с линейчатым спектром, интенсивным в коротковолновой части. Таким спектром излучения обладают ртутные лампы, работающие по принципу газового разряда. Лампы имеют специфичное светящееся тело. В кварцевую колбу вплавлены два электрода. В зоне горения содержится небольшое количество ртути. За счет разрядов определенной мощности высокого напряжения между электродами возникает электрическая световая дуга, которая поддерживается в «горящем» состоянии.

Ртутная лампа излучает интенсивный свет, содержащий значительную долю УФ-излучения, которое необходимо для наблюдения в свете люминесценции.

В оптическую схему люминесцентного микроскопа вводят два светофильтра. Между зеркалом микроскопа и источником света устанавливают сине-фиолетовый светофильтр. Он пропускает от источника-осветителя только сине-зелёный свет, возбуждающий люминесценцию. Вещества-флюорохромы поглощают падающие на них коротковолновые лучи, переходят в возбуждённое состояние и приобретают иной цвет. Обратный переход в нормальное состояние происходит с испусканием света с большей длиной волны. Сине-зелёный свет мешает видеть возбуждаемое им свечение препарата, поэтому по пути к глазу наблюдателя отсекается жёлтым светофильтром.

Люминесцирующие объекты светятся ярким светом в тёмном поле зрения (рис. 9, 10). Сила их света чаще невелика, поэтому люминесцентную микроскопию проводят в затемнённом помещении.

Рис. 9. Micobacterium tuberculosis (желтые) в люминесцентном микроскопе

Рис. 10. Escherichia coli (синие – живые, красные – погибшие) в люминесцентном микроскопе

Преимущества люминесцентной микроскопии:

· цветное светящееся изображение микроорганизмов на чёрном фоне;

· обнаружение и установление локализации и концентрации живых и погибших микроорганизмов;

· возможность обнаружения микроорганизмов в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой степени контрастности изображения;

· при использовании коротких УФ лучей разрешающая способность люминесцентного микроскопа увеличивается до 0,1мкм;

· экспресс-идентификация антигенов микроорганизмов в РИФ;

· возможность исследования прозрачных и непрозрачных объектов;

· возможность исследования жизненных процессов в динамике;

· использование люминесцентной микроскопии при цитологических и гистохимических исследованиях, так как флюорохромы могут распределяться в клетке диффузно либо избирательно окрашивать отдельные клеточные структуры или определенные химические соединения биологического объекта.

Возможности оптических микроскопов ограничены слишком большой длиной волны видимого света (6000 А). Объекты, размеры которых меньше этой величины, находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа и могут быть обнаружены только при электронной микроскопии.

Электронная микроскопия (ЭМ) предполагает использование электронного микроскопа (рис. 11), в котором для освещения объектов вместо светового пучка используются электронные лучи (поток электронов).

Целые клетки из-за своей большой толщины непрозрачны для пучка электронов. Поэтому ЭМ требует специальной подготовки объектов исследования. Материал после фиксации обезвоживают, заливают в эпоксидные смолы, режут стеклянными или алмазными ножами на специальных ультратомах, позволяющих получать ультратонкие срезы толщиной 30–50 нм.

Биологические объекты состоят из веществ, построенных из лёгких элементов (С, N, О, Н, Р, S), поэтому их изображение в электронном микроскопе слабо контрастно и в клетках можно увидеть очень мало структурных деталей. Чтобы сделать изображение более контрастным, клетки обрабатывают электронными красителями – солями тяжёлых металлов (свинца, ртути, хрома, урана, вольфрама). Так как атомы тяжёлых металлов очень сильно рассеивают электроны, то структуры клетки, поглотившие эти металлы, будут выглядеть тёмными и контрастными. В качестве индикаторов для окислительно-восстановительных ферментов в ЭМ используют теллурит калия или соли тетразолия. Эти соединения, проникая в клетки, акцептируют электроны, которые они получают от дегидрогеназ. В результате реакции эти соединения восстанавливаются и выпадают в осадок, имеющий вид электронно-плотных (тёмных на экране микроскопа) зёрнышек, глыбок, слоёв.