РАЗРЕШЕНИЕ КОНФОКАЛЬНОГО МИКРОСКОПА И 3 2 КОНФОКАЛЬНАЯ МИКРОСКОПИЯ

Конфокальная микроскопия имеет различные преимущества по сравнению с обычной оптической микроскопией, включая малую глубину резкости, устранение расфокусированных бликов и возможность серийного сбора оптических срезов из толстых образцов. Видное применение конфокальной микроскопии в биомедицинских науках — визуализация фиксированных или живых клеток и тканей, которые обычно метят одним или несколькими флуоресцентными зондами.

В настоящее время лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (LSCM) является наиболее используемой конфокальной версией для биомедицинских исследований. В этом введении LSCM выделен, так как это дизайн, который, скорее всего, встретит неопытные пользователи. В определенных нишах в области биологической визуализации предпочтение отдается альтернативным конструкциям оборудования. Большинство процессов подготовки образцов можно применять с небольшими изменениями к любой из версий конфокального оборудования и к другим методам создания оптических срезов, таким как методы деконволюции и многофотонная визуализация.

Что такое конфокальная рамановская микроскопия?

Конфокальная рамановская микроскопия — это тип микроскопии, в котором для получения изображений образца используется эффект комбинационного рассеяния света. Эффект Рамана – это неупругое рассеяние света, возникающее при взаимодействии фотона с молекула, что приводит к изменению энергии фотона. Это изменение энергии характерно для молекулы и может быть использовано для идентификации и характеристики химического состава образца.

Конфокальная рамановская микроскопия сочетает в себе принципы конфокальной микроскопии с рамановской спектроскопией, которая представляет собой метод, используемый для изучения колебательных, вращательных и других низкочастотных мод молекулы. Конфокальная рамановская микроскопия использует лазерный луч для сканирования образца и получения изображения с высоким разрешением, аналогично конфокальному микроскопу. Однако вместо использования флуоресценции для получения изображения конфокальная рамановская микроскопия использует эффект рамановского рассеяния для создания «карты рамановского рассеяния» образца. Эту карту можно использовать для идентификации и характеристики конкретных химических компонентов в образце.

Конфокальная рамановская микроскопия — это мощный инструмент для изучения химического состава небольших образцов и структур, который используется в самых разных областях, включая биологию, материаловедение и промышленный контроль.

Что такое конфокальный микроскоп?

Задача «Угадай слова»

Только пользователей способны решить эту задачу.

Угадай слово, спрятанное в этой истории

Конфокальный микроскоп отличается от «классического» оптического микроскопа (см. пункт 3.1) тем, что в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценное изображение строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы). Для того, чтобы регистрировать свет только от одной точки после объективной линзы располагается диафрагма малого размера таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой (красные лучи на рис. 1б), проходит через диафрагму и будет зарегистрирован, а свет от остальных точек (например, синие лучи на рис. 1б) в основном задерживается диафрагмой. Вторая особенность состоит в том, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку (рис. 1в). Это может достигаться расположением второй фокусирующей системы за образцом, но при этом требуется, чтобы образец был прозрачным. Кроме того, объективные линзы обычно сравнительно дорогие, поэтому использование второй фокусирующей системы для подсветки мало предпочтительно. Альтернативой является использование светоделительной пластинки, так чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом (рис. 1г). Такая схема к тому же облегчает юстировку.

Рис. 1а.  Ход лучей в обычном оптическом микроскопе, когда в фотоприемное устройство попадает свет из различных точек образца.

Рис. 1б.  Применение диафрагмы позволяет существенно снизить фоновую подсветку от точек образца вне анализируемой области.

Рис. 1в.  Дополнительное повышение контраста достигается применением подсветки, фокусирующей свет в анализируемую точку.

Рис. 1г.  Схема со светоделительной пластинкой упрощает конструкцию микроскопа и процесс юстировки за счет двойного использования объектива (для подсветки и сбора отраженного сигнала).

Разрешение и контрастность в конфокальном микроскопе.

Рассмотрим теперь математически, каким образом и насколько количественно изменяется контрастность при применении конфокальной микроскопии. Во-первых, так как в конфокальном микроскопе свет дважды проходит через объектив, то функция размытия точки (далее обозначаемая PSF, см. определение в предыдущем пункте 3.1) имеет вид

Для качественного понимания удобно рассматривать каждую PSF как вероятность того, что фотон попадет в точку с координатами

, либо что фотон будет зарегистрирован из точки с координатами

Если использовать критерий Релея для разрешения (провал 26% от максимума распределения), то мы получим, что разрешение в конфокальном микроскопе увеличивается, но не существенно. Для конфокального микроскопа

в то время как для обычного микроскопа

Однако основным достоинством конфокального микроскопа является не увеличение разрешения в смысле критерия Релея, а существенное увеличение контрастности. В частности для обычной PSF в фокальной плоскости отношение амплитуды в первом боковом максимуме к амплитуде в центре составляет 2%, для случая конфокального микроскопа это отношение будет 0.04%. На рис. 3 приведен практический пример, когда это важно. На верхней части рисунка мы видим, что тусклый объект (интенсивность в 200 раз меньше, чем у яркого) не возможно обнаружить в обычный микроскоп, хотя расстояние между объектами существенно больше того, что предписано критерием Релея. В то же самое время, в конфокальный микроскоп (нижняя часть рисунка 3) данный объект должен хорошо регистрироваться.

Распределение интенсивности вдоль оптической оси для конфокального микроскопа определяется выражением

Тогда пользуясь критерием Релея получим разрешение вдоль оптической оси

Здесь важно отметить, что не следует путать разрешение вдоль оптической оси и глубину фокуса в обычном микроскопе. Обычно глубина фокуса в сотни раз превышает разрешение вдоль оптической оси.

Влияние диафрагмы в фокальной плоскости.

Один из параметров, который никак не фигурировал в данном выше описании — это размер диафрагм в фокальной плоскости облучающей и собирающей линз. Отметим, что при анализе мы молчаливо предполагали источник точечным и именно в этом предположении получили функцию размытия точки (PSF) для обычного и конфокального микроскопа. Полученные PSF описывают свойства объективной линзы, а изображение диафрагмы в плоскости объекта определяет, свет из каких областей регистрируется фотодетектором. Очевидно, однако, что уменьшение размера диафрагмы приводит к уменьшению количества проходящего света, увеличивает уровень шума и, в конечном итоге, может свести на нет все достигнутые преимущества по контрастности. Таким образом, стоит вопрос об оптимальном выборе размера диафрагмы и разумном компромиссе.

Диафрагма с отверстием меньше размера пятна Эйри просто приводит к потере интенсивности и никак не влияет на разрешение. Диафрагма размером в одно пятно Эйри позволяет по максимуму использовать разрешающую способность объективной линзы. Однако размер диафрагмы примерно в 3-5 раза больше пятна Эйри представляется наиболее подходящим компромиссом. Следует понимать, что обсуждаемый здесь размер имеет смысл размера изображения в плоскости объекта, а поэтому реальный размер отверстия в диафрагме зависит от увеличения линзы. В частности, при использовании 100-кратной линзы диафрагма с отверстием 1 мм будет спроецирована в плоскость объекта в круг радиусом 10 мкм.

Для того, чтобы учесть наличие диафрагмы математически и построить новую функцию распределения интенсивности, следует выполнить свертку

а для конфокального микроскопа уже полученную функцию

Важно помнить

При разработке экспериментов с использованием конфокальной микроскопии необходимо учитывать различные факторы, некоторые из которых обсуждаются здесь.

Цели

Есть также некоторые недостатки использования конфокальной микроскопии, в том числе:

В целом, хотя конфокальная микроскопия является мощным инструментом для получения изображений с высоким разрешением небольших образцов и структур, у нее есть некоторые ограничения, которые могут сделать ее менее пригодной для определенных приложений.

Характеристики конфокального микроскопа

Есть несколько характеристик и особенностей конфокальных микроскопов, которые делают их мощным и универсальным инструментом для научных исследований:

В целом, высокое разрешение, возможности трехмерного изображения и возможности мультиплексирования конфокальных микроскопов делают их мощным и универсальным инструментом для изучения структуры и функций клеток, тканей и молекул на микроскопическом уровне.

КЛСМ широко используется практически во всех отраслях биологии, от клеточной биологии и генетики до микробиологии и биологии развития. Она также используется в квантовой оптике и нанокристаллической визуализации и спектроскопии.

Биология и медицина

Оптика и кристаллография

Применение конфокального микроскопа

Конфокальные микроскопы используются в самых разных областях, в том числе:

В целом, конфокальные микроскопы являются важным инструментом для исследователей и ученых, которым нужны изображения с высоким разрешением небольших образцов и структур.

Типы конфокальных микроскопов

Существует несколько типов конфокальных микроскопов, в том числе:

Справка

Стоимость конфокального микроскопа/цены на конфокальный микроскоп

Стоимость конфокального микроскопа может сильно варьироваться в зависимости от особенностей и возможностей прибора. Однофотонные конфокальные микроскопы могут стоить от нескольких тысяч до более чем 100,000 XNUMX долларов, в то время как двухфотонные и многофотонные конфокальные микроскопы могут стоить значительно дороже. Микроскопы со сверхвысоким разрешением, в которых используются такие методы, как STED или микроскопия со структурированным освещением, для достижения пространственного разрешения за пределами дифракционного предела света, могут стоить еще дороже.

Как правило, стоимость конфокального микроскопа будет зависеть от требуемого уровня детализации и разрешения, а также сложности изучаемого образца. Более совершенные конфокальные микроскопы с более высоким разрешением и возможностями мультиплексирования, как правило, будут дороже. Прежде чем выбрать конфокальный микроскоп, важно тщательно рассмотреть конкретные потребности вашего исследования или приложения, поскольку для получения желаемого уровня детализации и разрешения может потребоваться вложение средств в более дорогой инструмент.

Преимущества конфокальной микроскопии

Использование конфокальной микроскопии имеет несколько преимуществ, в том числе:

В целом, конфокальная микроскопия является мощным инструментом для получения детальных изображений с высоким разрешением небольших образцов и структур и широко используется в ряде исследовательских и промышленных приложений.

Пример изображений, полученных методом КЛСМ

Схема конфокального микроскопа из патента Марвина Мински

Схема тандем-сканирующего микроскопа

Совмещение конфокального микроскопа с лазерным осветителем

Лабораторный макет конфокального лазерного сканирующего микроскопа

Принцип конфокального микроскопа

Принцип конфокального микроскопа

В конфокальных микроскопах используется флуоресцентная оптика, как и в широкопольных микроскопах. Вместо того, чтобы освещать весь образец, лазерный свет фокусируется на фиксированной точке на определенной глубине. Здесь излучается флуоресцентный свет. Детектор света принимает сигналы флуоресценции только от освещенного места, потому что отверстие в оптическом канале блокирует сигналы не в фокусе.

Одна оптическая плоскость сканируется путем растрирования образца. Сканируйте множество оптических плоскостей и используйте программное обеспечение для деконволюции микроскопа для визуализации 3D-объектов (z-stack). Современные конфокальные микроскопы с несколькими лазерами и фильтрами эмиссии/возбуждения могут изучать многоцветные иммунофлуоресцентные окрашивания.

Изображение конфокального микроскопа

Изображение с конфокального микроскопа — Центральная нервная система Onthophagus sagittarius, изображение-победитель конкурса FASEB BioArt 2016 г.

Изображение конфокального микроскопа — конфокальная микроскопия эмбриона кальмара.

Изображение с конфокальной микроскопии – флуоресценция корня ячменя.

Изображение с конфокального микроскопа — индуцированная человеком колония плюрипотентных стволовых клеток

Изображение с конфокального микроскопа – митохрондия конуса

Изображение с конфокальной микроскопии — цветное изображение актиновых филаментов в раковой клетке.

Изображение конфокального микроскопа. Эта проекция нескольких конфокальных изображений, сделанных в установке световой микроскопии EMBL, показывает группу диатомовые с голубыми клеточными стенками, красными хлоропластами, синей ДНК и зелеными мембранами и органеллами

Изображение с конфокальной микроскопии -β-тубулин у Tetrahymena (реснитчатого простейшего).

Изображение с конфокальной микроскопии — зеленый сигнал от антитела к тубулину, конъюгированного с Alexa Fluor 488, и ядра (синий сигнал от ДНК, окрашенной DAPI) в клетках корневой меристемы 4-дневного растения Arabidopsis thaliana (Col-0). Масштабная линейка: 5 мкм.

Конфокальное микроскопическое изображение лазерно-индуцированной хориоидальной неоваскуляризации (CNV)

Проверьте больше Изображение с конфокального микроскопа – https://www.flickr.com/search/?text=Confocal%20microscope%20image

Принцип работы флуоресцентного и конфокального микроскопа

Схема конфокального микроскопа. Рассеянный свет, идущий из глубины образца (пунктирные линии синего цвета), отрезаются апертурами, что обеспечивает высокий контраст изображения

Оптическая схема обычного светового микроскопа формирует изображение всей части образца, находящегося в ГРИП используемого микрообъектива, а конфокальный микроскоп формирует изображение очень тонкого среза объекта на одном уровне глубины. По сути, метод КЛСМ достигается за счет контролируемого ограничения глубины фокуса оптической системы.

Поскольку на образце регистрируется только одна флуоресцирующая точка, то для формирования двумерного или трехмерного изображения требуется растровое сканирование образца. Лазерный пучок перемещается по образцу в горизонтальной плоскости с использованием одного или нескольких зеркал с управляемым углом наклона. Этот метод сканирования обычно имеет низкую скорость сканирования, которая, однако, может варьироваться. Так, более медленное сканирование обеспечивает лучшее соотношение сигнал/шум, что приводит к лучшему контрасту и более высокому разрешению.

Конфокальный микроскоп имеет разрешение такое же как и обычный микроскоп и ограничено оно дифракционным пределом.

Рассмотрим теперь вопрос увеличения контрастности при использовании конфокальной оптической схемы. Во-первых, так как в конфокальном микроскопе свет дважды проходит через объектив, то функция размытия точки (далее обозначаемая PSF) имеет следующий вид:

где Pconf — конфокальная функция размытия точки, а p — обычная функция размытия точки.

Визуализация GFP-меченых белков вируса в табачном листе с помощью конфокальной микроскопии

Таким образом, достижимая толщина фокальной плоскости определяется в основном длиной волны используемого излучения, деленной на числовую апертуру объектива, а также зависит от оптических свойств образца. Благодаря тонкому оптическому срезу эти типы микроскопов особенно хороши для 3D-визуализации и поверхностном профилировании образцов.

Части конфокального микроскопа

Части конфокального микроскопа

Есть несколько ключевых частей конфокального микроскопа:

В целом, эти части работают вместе для получения трехмерных изображений образца с высоким разрешением с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM).

Литература.

Функция размытия точки (PSF) в конфокальном микроскопе

Многоканальная спектральная конфокальная микроскопия. Органеллы в клетках Marchantia polymorpha thallus

где n — относительный показатель преломления, D — диаметр входного зрачка оптической системы, λ — длина волны, F — фокусное расстояние микрообъектива, θ — апертурный угол микрообъектива, λ’=λ/n. Для обычного светового микроскопа разрешение (rr):

Однако основным достоинством конфокального микроскопа является не увеличение разрешения в смысле критерия Релея, а существенное увеличение контрастности. В частности для обычной PSF в фокальной плоскости отношение амплитуды в первом боковом максимуме к амплитуде главного максимума составляет 2 %, для случая конфокального микроскопа это отношение будет 0,04 %.