Метафазная пластинка с филадельфийской хромосомой. Хромосомы окрашены в синий цвет, локус ABL1 — красный цвет, локус BCR — зелёный цвет. Вверху слева — хромосома с перестройкой, отмечена красно-зеленой точкой
Флуоресце́нтная гибридиза́ция in situ, или метод FISH (англ. fluorescence in situ hybridization — FISH), — цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ. Кроме того, FISH используют для выявления специфических мРНК в образце ткани. В последнем случае метод FISH позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в клетках и тканях.
Цитогенетические аномалии — это генетические дефекты, затрагивающие большие участки хромосом, а не маленькие фрагменты ДНК (например, транслокации, большие делеции или анеуплоидии). Эти дефекты могут быть обнаружены по меньшей мере тремя методами – хромосомным (кариотипическим) анализом, флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH) с использованием специфических ДНК-зондов либо на метафазных хромосомах, либо на межфазных ядрах и сравнительной геномной гибридизацией массива (aCGH). Последние два метода считаются “молекулярной цитогенетикой”, поскольку они могут обнаруживать аномалии, которые ниже разрешения хромосомного анализа.
Современный метод цитогенетического анализа, позволяющий определять качественные и количественные изменения хромосом (в том числе транслокации и микроделеции) и используемый для дифференциальной диагностики злокачественных заболеваний крови и солидных опухолей.
Необходимо предоставить все имеющиеся гистологические препараты (стекла и блоки) + стекла ИГХ (самое главное – на HER2). Также необходимо предоставить первичный гистологический протокол и протокол ИГХ-исследования.
В блоках должно быть достаточно опухолевого материала для дополнительных срезов.
Флуоресцентная гибридизация in situ
Fluorescence in-situ hybridization
Флуоресцентная гибридизация in situ.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Образец ткани, образец ткани в парафиновом блоке.
Как правильно подготовиться к исследованию?
Подготовки не требуется.
Общая информация об исследовании
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH, от англ. fluorescence in-situ hybridization) – это один из самых современных методов диагностики хромосомных аномалий. Он основан на использовании ДНК-проб, меченных флуоресцентной меткой. Д НК-пробы представляют собой специально синтезированные фрагменты ДНК, последовательность которых комплементарна последовательности ДНК исследуемых аберрантных хромосом. Таким образом, ДНК-пробы различаются по составу: для определения разных хромосомных аномалий используются разные, специфические ДНК-пробы. Д НК-пробы также различаются по размеру: одни могут быть направлены к целой хромосоме, другие – к конкретному локусу.
В ходе процесса гибридизации при наличии в исследуемом образце аберрантных хромосом происходит их связывание с ДНК-пробой, которое при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа определяется как флуоресцентный сигнал (положительный результат FISH-теста). При отсутствии аберрантных хромосом несвязанные ДНК-пробы в ходе реакции «отмываются», что при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа определяется как отсутствие флуоресцентного сигнала (отрицательный результат FISH-теста). Метод позволяет оценить не только наличие флуоресцентного сигнала, но и его интенсивность и локализацию. Таким образом, FISH-тест – это не только качественный, но и количественный метод.
FISH-тест обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами цитогенетики. В первую очередь, исследование FISH может быть применено как к метафазным, так и к интерфазным ядрам, то есть к неделящимся клеткам. Это основное преимущество FISH по сравнению с классическими способами кариотипирования (например, окрашиванием хромосом по Романовскому-Гимзе), которые применяются только к метафазным ядрам. Благодаря этому исследование FISH является более точным методом для определения хромосомных аномалий в тканях с низкой пролиферативной активностью, в том числе в солидных опухолях.
Так как в FISH-тесте используется стабильная ДНК интерфазных ядер, для исследования могут быть использованы самые различные биоматериалы – аспираты тонкоугольной аспирационной биопсии, мазки, аспираты костного мозга, биоптаты и, что немаловажно, сохраненные фрагменты ткани, например гистологические блоки. Так, например, FISH-тест может быть с успехом выполнен на повторных препаратах, полученных из гистологического блока биоптата молочной железы при подтверждении диагноза «аденокарцинома молочной железы» и необходимости определения HER2/neu-статуса опухоли. Следует особо подчеркнуть, что в данный момент исследование FISH рекомендовано в качестве подтверждающего теста при получении неопределенного результата иммуногистохимического исследования опухоли на онкомаркер HER2/neu(ИГХ 2+).
Другим преимуществом FISH является его способность определять микроделеции, которые не выявляются с помощью классического кариотипирования или ПЦР. Это имеет особое значение при подозрении на синдром Ди Джорджи и велокардиофациальный синдром.
FISH-тест широко используется в дифференциальной диагностике злокачественных заболеваний, в первую очередь в онкогематологии. Хромосомные аномалии в сочетании с клинической картиной и данными иммуногистохимического исследования являются основой классификации, определения тактики лечения и прогноза лимфо- и миелопролиферативнх заболеваний. Классическими примерами являются хронический миелолейкоз – t (9;22), острый промиелоцитарный лейкоз – t (15;17), хронический лимфолейкоз – трисомия 12 и другие. Что касается солидных опухолей, наиболее часто FISH-исследование применяется при диагностике рака молочной железы, мочевого пузыря, толстой кишки, нейробластомы, ретинобластомы и других.
Исследование FISH также может быть использовано в пренатальной и преимплантационной диагностике.
FISH-тест часто проводят в сочетании с другими методами молекулярной и цитогенетической диагностики. Результат этого исследования оценивают в комплексе с результатами дополнительных лабораторных и инструментальных данных.
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Что означают результаты?
Что может влиять на результат?
Кто назначает исследование?
Онколог, педиатр, акушер-гинеколог, врач-генетик.
Цитогенетическое исследование — это микроскопический анализ хромосом, результаты которого весьма важны для постановки диагноза, классификации, лечения и научного исследования заболеваний системы крови, прежде всего — онкогематологических. Значение цитогенетических методов для диагноза и лечения определяется доступностью опухолевых клеток для кариотипирования и их гетерогенностью, а с научной точки зрения — возможностью изучения изменений в структуре и функции генетических локусов, ассоциированных со злокачественной трансформацией.
Морфология хромосом сильно варьирует во время клеточного цикла. Для микроскопического анализа хромосомы должны быть визуализированы как дискретные структуры. Наилучшим образом это достигается на стадии прометафазы митоза, когда каждая хромосома видна как две идентичные хроматиды, и особенно на стадии метафазы, когда хромосомы максимально конденсированы и располагаются в одной плоскости в центре клетки отдельно одна от другой.
Нормальные клетки человека содержат 22 пары аутосом и одну пару половых хромосом: две Х-хромосомы у женщин и по одной копии половых хромосом (X и Y) у мужчин.
Для цитогенетического анализа лейкозов, миелодиспластических синдромов и хронических миелопролиферативных заболеваний исследуют клетки костного мозга. При невозможности их получения может быть исследована кровь (если она содержит бласты). Цитогенетический анализ лимфом выполняется в клетках ткани лимфатического узла. Культивирование клеток из опухоли повышает митотический индекс (пропорцию клеток, находящихся в фазе митоза) и способствует пролиферации злокачественных клеток.
Сравнительное кариотипирование нормальных клеток проводят в Т-лимфоцитах периферической крови, которые предварительно культивируют в среде с митогеном растительного происхождения — фитогемагглютинином.
Окрашивание хромосом в гематологии
В конце 1960-х годов была разработана методология дифференциального окрашивания метафазных хромосом, а в 1971 г. создана номенклатура хромосомных сегментов, позволяющая точно описывать хромосомные аномалии. Позднее были внедрены методики окрашивания менее конденсированных и, соответственно, более длинных профазных и прометафазных хромосом, которые обладают более высоким разрешением, так как позволяют визуализацию 500-2000 сегментов (метафазное окрашивание визуализирует только 300 сегментов).
Достаточно большое количество профазных и прометафазных клеток для анализа получают путем синхронизации клеточного цикла, культивируя клетки в среде, содержащей антиметаболит (например, метотрексат), который ингибирует синтез ДНК. Подавление синтеза ДНК останавливает клеточный цикл в интерфазе. Затем клетки переносят в среду без метотрексата, обогащенную тимидином, где они одновременно входят в фазу митоза. Обработка клеточной культуры колхицином останавливает митоз одновременно во всех клетках на стадии профазы или прометафазы.
Первая стойкая хромосомная аномалия при злокачественной опухоли человека была выявлена в 1960 г. у больных хроническим миелолейкозом и получила название филадельфийской хромосомы (Ph), по имени города, в котором было сделано это открытие. Применение технологии хромосомного окрашивания позволило выявить множество хромосомных аномалий, большая часть которых встречается при онкогематологических заболеваниях. Некоторые красители окрашивают различные участки хромосом с вариабельной интенсивностью в зависимости от структуры хроматина в этих участках, их нуклеотидного и белкового состава.
В результате такого окрашивания получают уникальный паттерн чередования светлых и темных поперечных полос, специфичный для каждой хромосомы.
В настоящее время существуют несколько видов дифференциального окрашивания хромосом. При Q-окрашивании акрихин-ипритом (quinacrine) или акрихиндигидрохлоридом выявляется особый тип флюоресценции каждой хромосомы с образованием Q-исчерченности (Q-banding) — поперечных флюоресцентных полос, называемых Q-полосами (Q.-bands). Это позволяет идентифицировать отдельные хромосомы. Анализ Q-полос выполняют с помощью флюоресцентного микроскопа.
Схема анализа ДНК методом FISH
При окрашивании по Гимзе (G-banding) хромосомы приобретают вид серии темных и светлых полос или бэндов (bands). G-окрашивание применяется чаще, чем Q-окрашивание, так как анализ выполняется с помощью светового микроскопа, а G-полосы, в отличие от Q-полос, не выцветают со временем. Наиболее широко применяется методика, называемая GTG-окрашиванием (G bands by trypsin using Giemsa), с предварительной обработкой трипсином.
R-бэндинг (обработка хромосом горячим спиртовым раствором перед окрашиванием по Гимзе) выявляет полосы, которые обратны G-полосам и называются R-полосами (reverse of G bands).
Помимо Q-, G- и R-окрашивания, позволяющих выявлять полосы вдоль всей длины хромосомы, существуют методики, специализированные для исследования отдельных хромосомных структур, в том числе конститутивного гетерохроматина (С-окрашивание — от англ. constitutive), теломерного района (Т-окрашивание) и района ядрышкового организатора (NOR-окрашивание — от англ. nucleolus organizing region). Размеры и положение С-полос уникальны для каждой хромосомы, но преимущественно они включают центромерныи район и используются при исследовании хромосомных транслокаций, вовлекающих центромерные районы хромосом.
Цитогенетический анализ опухолевых клеток затруднен в связи с неясной морфологией хромосом и слабой различимостью полос. Если в исследование взяты наиболее удобные для анализа метафазные пластинки, образец может быть ошибочно охарактеризован как цитогенетически нормальный.
С развитием методов рекомбинантной ДНК стало возможным использование гибридизации in situ для определения местоположения на хромосомах или в клеточном ядре любой ДНК- и РНК-последовательности. С ее помощью можно изучать и диагностировать онкологические и наследственные генетические болезни. Молекулярная гибридизация in situ является важным инструментом цитогенетических исследований, позволяет выявлять хромосомные перестройки, идентифицировать маркерные хромосомы, проводить быстрое кариотипирование клеточных линий. Важно, что подобный анализ можно проводить не только на метафазных хромосомах, но и на интерфазных ядрах.
Разрешающая способность «интерфазной цитогенетики» на два порядка выше, чем классической цитогенетики.
Несмотря на многоцелевое использование молекулярной гибридизации ДНК-ДНК (РНК) in situ, все модификации метода выполняются в соответствии с общими принципами. Существуют несколько вариантов, которые включают в себя несколько этапов: подготовка и мечение ДНК (РНК)-зонда, приготовление препаратов хромосом, собственно гибридизация, детекция гибридных молекул.
В 1980-х годах цитогенетическая методология обогатилась молекулярно-цитогенетическим методом, называемым флюоресцентной гибридизацией in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH), который вскоре стал наиболее популярным. Суть этого метода заключается в гибридизации ДНК-зондов к специфическим последовательностям ДНК, меченных флюорохромами, с метафазными или интерфазными хромосомами, которые визуализируются флюоресцентной микроскопией. Определение нуклеотидной последовательности методом FISH выполняется непрямым способом, путем гибридизации синтетического олигонуклеотида (зонда) с анализируемой ДНК (называемой также матричной ДНК или ДНК-мишенью).
Если зонд синтезирован с включением флюоресцентных или антигенных молекул, которые распознаются флюоресцирующими антителами, становится возможной визуализация относительного положения зонда на анализируемой ДНК.
Флюорохром может быть связан с ДНК ковалентно (прямое мечение) или посредством иммуноцитохимических реакций, когда ДНК-зонд метят гаптеном (биотин, дигоксигенин), а флюорохром связан с алкалоидом авидином (стрептавидином), обладающим сильным сродством к биотину (или с антителами против биотина или дигоксигенина). При использовании гаптенов возможна амплификация флюоресцентного сигнала с помощью биотинилированных антител к авидину и вторичных антител, специфичных предыдущему слою антител и окрашенных флюорохромом.
Для амплификации флюоресцентного сигнала применяется метод «иммунных сэндвичей». Например, на препарат, изображенный на схеме, наносят биотинилированные антитела к авидину, а затем снова комплекс авидин-флюоресцеин. При необходимости цикл может быть повторен. Антитела в свою очередь выявляются с помощью ферментативного (например, авидинпероксидазы) или флюоресцентного детектора.
Метод FISH предназначен для выявления:
1) гибридных клеток;
2) транслокаций и других, в том числе числовых, хромосомных аномалий;
3) меченых хромосом в интерфазных и метафазных клетках.
Высококонтрастная флюоресцентная гибридизация достигается благодаря использованию флюоресцентных красителей разного цвета. С помощью двуцветной FISH выявляются тонкие структурные аномалии, например хромосомные транслокации, в том числе и неразличимые при дифференциальном окрашивании.
В настоящее время возможно выполнение многоцветной гибридизации in situ для одновременного окрашивания всех хромосом в сложном кариотипе с множественными числовыми и структурными аномалиями. Комбинация разных модифицирующих агентов и флюорохромных красителей позволяет одновременно выявлять несколько последовательностей ДНК в одном ядре (флюоресцеин дает зеленую флюоресценцию, техасский красный и родамин — красную, гидроксикумарин — голубую и т. д.). Сочетание пяти флюорохромов в разных пропорциях и компьютерный анализ изображений позволяет одновременно окрасить разным цветом все хромосомы и визуализировать 27 различных ДНК-зондов, которые служат уникальной меткой для каждой хромосомы. Эта методика называется многоцветной FISH (multicolor, или multiplex, fluorescence in situ hybridization, M-FISH).
Значение цитогенетических методов неодинаково при разных онкогематологических заболеваниях. Миелоидные клетки обычно легко кариотипируются при дифференциальном окрашивании, и FISH лишь подтверждает результаты рутинной цитогенетики. Лимфоидные клетки у больных хроническим лимфолейкозом и, особенно, множественной миеломой кариотипировать значительно сложнее из-за низкого уровня пролиферации (даже при использовании В-клеточных митогенов). В этом случае FISH демонстрирует в несколько раз большую частоту анеуплоидии, чем обычные цитогенетические методики.
Клиническое значение цитогенетических исследований
Диагноз. Потомство клетки с приобретенной цитогенетической аномалией может иметь пролиферативное преимущество и давать начало клону — клеточной популяции, происходящей от одной клетки-предшественницы. Обнаружение клональных хромосомных аномалий способствует постановке диагноза клонального поражения костного мозга. Например, цитогенетический анализ позволяет установить диагноз миелодиспластического синдрома у пациентов с умеренной цитопенией или при наличии в аспирате костного мозга минимально выраженных качественных нарушений гемопоэза.
Присутствие специфических хромосомных аномалий помогает выделить подгруппы пациентов, которым требуется специфическая терапия. Например, транслокация t(15;17)(q22;qll-21) подтверждает диагноз острого промиелоцитарного лейкоза (ОМЛ — МЗ), в комплексном лечении которого используется ретиноевая кислота.
Прогноз. Результаты цитогенетического анализа имеют не только диагностическое, но и прогностическое значение. Например, обнаружение множественных хромосомных аномалий у больных острыми лейкозами до начала лечения является прогностически неблагоприятным и служит основанием для выполнения трансплантации костного мозга или стволовых клеток периферической крови в первой полной ремиссии.
Контроль результатов лечения. Цитогенетический анализ костного мозга пациентов после проведенного лечения помогает контролировать степень элиминации опухолевого клона и, следовательно, полноту ремиссии. Выявление хромосомных аномалий, характерных для опухолевых клеток данного пациента, является ранним признаком, свидетельствующим о приближающемся рецидиве.
Цитогенетический анализ имеет большое значение в диагностике и лечении гематологических заболеваний, которое все возрастает по мере совершенствования методологии и накопления знаний об этиологической и патогенетической роли хромосомных аномалий в развитии этих болезней.
Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021
— Также рекомендуем «Кариотипирование в гематологии. Классификация хромосом»
Кариотипирование при помощи многоцветного FISH
Флуоресцентная гибридизация in situ на хромосомах курицы. Стрелки указывают на меченные локусы гомологичных макрохромосом; видны также многочисленные мелкие пятнышки — микрохромосомы
Мечение зонда может осуществляться разными способами, например, путём ник-трансляции или при помощи ПЦР с мечеными нуклеотидами.
RGEN-ISL Метод молекулярной визуализации с помощью РНК-направляемой эндонуклеазы CRISPR/dCas9 связанной с меткой. В отличие от классической флуоресцентной гибридизации in situ, RGEN-ISL не требует денатурации ДНК и, следовательно, обеспечивает лучшую сохранность структуры хроматина.
Спектральное кариотипирование
Спектральное кариотипирование (SKY, также называемое многоцветным FISH) — это метод FISH, точно определяющий хромосомное происхождение всех элементов в кариограмме (полный набор хромосом) с использованием нескольких длин волн света для генерации сигналов многих цветов. Комбинацию из пяти флуорохромов можно использовать в качестве зондов, чтобы «окрасить» все 22 аутосомы, а также X- и Y-хромосомы в разные цвета. Кариограмма анализируется с помощью компьютеризированного спектрального устройства формирования изображений, и хромосомы классифицируются на основе их конкретных спектров излучения.
Преимущества этой техники:
Схема эксперимента по флуоресцентной гибридизации in situ для локализации положения гена в ядре
На первом этапе происходит конструирование зондов. Размер зонда должен быть достаточно большим для того, чтобы гибридизация происходила по специфическому сайту, но и не слишком большой (не более 1 тыс. п. о.), чтобы не препятствовать процессу гибридизации. При выявлении специфических локусов или при окраске целых хромосом надо заблокировать гибридизацию ДНК-проб с неуникальными повторяющимися ДНК-последовательностями путём добавления в гибридизационную смесь немеченой ДНК повторов (например, Cot-1 DNA). Если ДНК-зонд представляет собой двуцепочечную ДНК, то перед гибридизацией её необходимо денатурировать.
На следующем этапе приготавливают препараты интерфазных ядер или метафазных хромосом. Клетки фиксируют на субстрате, как правило, на предметном стекле, затем проводят денатурацию ДНК. Для сохранения морфологии хромосом или ядер денатурацию проводят в присутствии формамида, что позволяет снизить температуру денатурации до 70 °C.
Далее к препарату добавляют зонды и осуществляют гибридизацию около 12 часов. Затем проводят несколько стадий отмывок для удаления всех негибридизовавшихся зондов.
Визуализацию связавшихся ДНК-зондов проводят при помощи флуоресцентного микроскопа. Интенсивность флуоресцентного сигнала зависит от многих факторов — эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флуоресцентного красителя.
Флуоресцентная гибридизация in situ
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) — это метод, позволяющий подсчитывать количество и расположение крупных фрагментов хромосом. Этот метод значительно повысил чувствительность, специфичность и разрешение хромосомных анализов. F ISH можно проводить на метафазных хромосомах или интерфазных ядрах; интерфазную FISH можно проводить на ткани, залитой в парафин.
Метафазная флуоресцентная гибридизация in situ позволяет идентифицировать крупные хромосомные аномалии, включая делеции, дупликации и транслокации, а также более мелкие хромосомные микроделеции и дупликации. Для метафазной FISH клетки останавливаются в митозе, как и для хромосомного связывания. Затем их фиксируют смесью уксусной кислоты и метанола, а затем «капают» на предметное стекло микроскопа, где они прикрепляются. Используются ДНК-зонды длиной в несколько сотен килобаз (кб), которые соответствуют участкам хромосом, содержащим рассматриваемую последовательность ДНК. Эти зонды непосредственно гибридизуются с хромосомами на предметном стекле (отсюда и термин «гибридизация in situ»). Немедленное обнаружение флуоресцентного сигнала возможно с помощью флуоресцентной микроскопии. Также доступны менее широко используемые методы изотопной и неизотопной химической маркировки.
Зонды FISH производят флуоресцентную точку на хромосоме, с которой они гибридизуются. Таким образом, каждая пара хромосом (или хромосомных участков) дает две точки. Эти двойные точки иногда сливаются, образуя один сигнал. Клетки, являющиеся моносомными для рассматриваемой хромосомной области, будут показывать только одну точку на ядро, в то время как трисомные клетки будут показывать три точки.
Флуоресцентную гибридизацию in situ также можно модифицировать для анализа интерфазных ядер.
Преимущества этого метода:
Сравнительная геномная гибридизация
Сравнительная геномная гибридизация (CGH) позволяет обнаруживать амплификации и делеции небольших участков ДНК по длине всех хромосом. Этот метод работает путем сравнения геномного содержимого (или ДНК) пациента (или мишени) с нормальным контрольным индивидуумом (или индивидуумами). Разрешение «классического» или метафазного CGH относительно низкое (примерно 15 Мб ДНК).
Массив CGH представляет собой модификацию сравнительной геномной гибридизации, в которой ДНК, РНК или ткань сравнения располагаются на предметном стекле или стеклянных шариках. Существует три основных типа массивов: массивы бактериальных искусственных хромосом (ВАС), массивы олигонуклеотидов (обычно длиной 60 пар оснований) или массивы однонуклеотидного полиморфизма (SNP) (обычно несколько нуклеотидов). Большинство массивов на основе SNP также включают зонды с одним локусом, а также SNP.
Существует как минимум два разных типа массивов: «целевые» массивы и массивы целых геномов.
Массивы как SNP, так и олигонуклеотидов могут обнаруживать вариации числа копий, но только массивы SNP можно использовать для определения отсутствия или потери гетерозиготности (AOH или LOH) для различных областей или даже целых хромосом при наличии нормального числа копий. A OH относится к наследованию только отцовских или материнских аллелей. Отсутствие наследования от двух родителей можно увидеть при одноплодной дисомии (UPD) или в некоторых образцах раковой ткани.
Одноплодная дисомия может быть результатом гетеродисомии, при которой присутствуют две разные гомологичные хромосомы от одного и того же родителя (либо по материнской, либо по отцовской линии) вместо нормального вклада двух родителей (по одной хромосоме от каждого родителя). Альтернативно, одноплодная дисомия может возникать при наличии двух идентичных копий одной родительской хромосомы (изодисомия). S NP-массивы могут обнаруживать только UPD, вторичные по отношению к изодисомиям.
Интерпретация массива CGH также может быть осложнена присутствием вариантов числа копий (CNVs), которые могут быть доброкачественными, патогенными или неизвестными.
Преимущества массива CGH:
Недостатками этой техники считаются:
Продолжение статьи
Интерфазная флуоресцентная гибридизация in situ используется, когда делящиеся клетки недоступны (например, в полностью дифференцированных клетках или в тканях, которые были зафиксированы и залиты парафином). Это также улучшает разрешение зондов FISH.
Для интерфазной FISH клетки тестируют с помощью FISH-зондов без синхронизации клеточного цикла. При использовании интактных ядер (например, не из ткани, залитой парафином) клетки собирают с помощью гипотонического раствора, фиксируют и снова «капают» на предметные стекла. Для FISH на тканях, залитых в парафин, делают тонкие срезы патологических образцов и прикрепляют к предметным стеклам.
Поскольку хромосомы лишь минимально конденсируются в интерфазе, эта модификация анализа FISH предоставляет возможность гибридизировать зонды с высоким разрешением (значительно меньше 1 Мб, по сравнению с 2 Мб для метафазного анализа FISH).
В интерфазном ядре невозможно различить хромосомные структуры и будет светиться только гибридизированный зонд. Гибридизация с двумя разными цветовыми зондами, пересекающими области точек разрыва генов, участвующих в транслокации, приводит к ожидаемым сигналам от нормальной хромосомы, а также к сигналу слияния от производной хромосомы (хромосом), на которой гены сопоставляются в результате транслокации.
Преимущества интерфазной FISH включают более высокое разрешение, чем метафазная FISH. Имеется возможность проведения теста сразу, без культивирования клеток, что делает его более быстрым. Интерфазная FISH имеет особое значение в пренатальной диагностике различных состояний анеуплоидии, таких как трисомия 18 или трисомия 21, при которых возможность быстрого получения результатов помогает в принятии решения.
Основным недостатком интерфазы по сравнению с метафазной FISH считается то, что при интерфазной FISH невозможно визуализировать сами хромосомы. Таким образом, невозможно предоставить информацию об общем количестве и составе хромосом.
Хромосомный анализ
Хромосомный анализ (также называемый бэндингом хромосом) используется для обнаружения изменений в больших участках хромосом (транслокаций, крупных делеций или анеуплоидий).
Для проведения хромосомного анализа лимфоциты, обычно полученные из периферической крови, культивируют in vitro и стимулируют к делению под действием митогенов. Также могут быть проанализированы, часто без митогенного стимула, другие типы клеток: амниоциты, клетки костного мозга, фибробласты и опухолевые клетки. Как только клетки легко делятся, добавляется химическое вещество для остановки митотического деления в метафазе. В этой фазе клеточного цикла хромосомы максимально сжаты, и, следовательно, их полосы легче распознать.
Для идентификации каждой отдельной хромосомы используется хромосомное бэндирование, необходимое для оценки того, присутствует ли правильное количество каждой хромосомы (две из каждой аутосомы плюс половые хромосомы) и имеются ли структурные аномалии. Эта техника может быть выполнена с использованием различных ферментов и красителей. Наиболее часто используемый метод полос — GTG (G-полоса с трипсином и полоса Гимзы). Идентичный образец полос наблюдается при Q-полосовании, при котором хромосомы окрашиваются флуоресцентным красителем и просматриваются в ультрафиолетовом свете.
Типичное разрешение бэндинга хромосом составляет около 400 полос в гаплоидном наборе из 23 хромосом. Одна полоса хромосом может содержать 6 мегабаз (Mb) ДНК и примерно 150 генов. Если требуется более высокое разрешение полос для изучения относительно небольших хромосомных перестроек, клеточные циклы могут быть синхронизированы, и клетки могут быть остановлены в прометафазе (550 полос) или даже профазе (приблизительно 800 полос). Последний метод называется полосованием с высоким разрешением.
Примеры использования этого метода включают оценку пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ).
Преимущества хромосомного бэндинга:
Недостаток: большинство методов кольцевания хромосом позволяют обнаружить только основные структурные аномалии и не обнаруживают увеличения или потери меньших участков ДНК.
